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通过促进胆固醇排泄，抑制 ASGR1 可降低脂质水平
原文：Ju-Qiong Wang et al., Nature 608, 413-420 (2022)
DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05006-3
源文件：~/Downloads/thesis_0520_xx.pdf
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文章信息
题目：通过促进胆固醇排泄，抑制 ASGR1 可降低脂质水平
作者：王菊琼、李亮亮、胡奥、邓刚、魏健、李云峰、刘远斌、卢晓艺、邱志平、施雄杰、赵晓露、罗杰、宋保亮
通讯作者：宋保亮，武汉大学生命科学学院、泰康生命医学中心、泰康医学院
接收日期：2021 年 8 月 22 日
接受日期：2022 年 6 月 22 日
在线发表：2022 年 8 月 3 日
摘要
高胆固醇是心血管疾病的主要危险因素。目前尚无药物能够通过直接促进胆固醇排泄来降低胆固醇。人类遗传学研究发现，去唾液酸糖蛋白受体 1（asialoglycoprotein receptor 1, ASGR1）的功能缺失变异与较低胆固醇水平以及较低心血管疾病风险相关。
ASGR1 只在肝脏中表达，负责介导血液中去唾液酸糖蛋白的内吞和溶酶体降解。ASGR1 影响胆固醇代谢的机制此前并不清楚。本文发现，Asgr1 缺失通过稳定 LXRα，降低血清和肝脏中的脂质水平。LXRα 上调 ABCA1 和 ABCG5/G8，分别促进胆固醇转运到高密度脂蛋白（HDL），以及排泄到胆汁和粪便中。
ASGR1 缺失会阻断糖蛋白的内吞和溶酶体降解，降低溶酶体中的氨基酸水平，由此抑制 mTORC1 并激活 AMPK。一方面，AMPK 通过降低 LXRα 的泛素连接酶 BRCA1/BARD1 来增加 LXRα；另一方面，AMPK 抑制控制脂肪生成的 SREBP1。抗 ASGR1 中和抗体可通过增加胆固醇排泄来降低脂质水平，并与两种常用降胆固醇药物阿托伐他汀或依折麦布产生协同有益作用。
总之，本研究表明，靶向 ASGR1 可上调 LXRα、ABCA1 和 ABCG5/G8，抑制 SREBP1 和脂肪生成，从而促进胆固醇排泄并降低脂质水平。
引言
胆固醇稳态依赖肠道胆固醇吸收、血浆脂蛋白摄取、从头合成、胆固醇分解代谢和排泄之间复杂的相互作用。迄今为止，主要有三类降胆固醇药物。
第一类是他汀类药物，即 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A 还原酶（HMGCR）的竞争性抑制剂。它通过降低胆固醇生物合成、上调 LDL 受体（LDLR）并增强低密度脂蛋白（LDL）摄取来降低血浆胆固醇。第二类是依折麦布，它是肠道胆固醇吸收抑制剂，通过抑制 Niemann-Pick C1-like 1（NPC1L1）的内吞来阻断胆固醇摄入。第三类是 PCSK9 抑制剂，它通过稳定 LDLR 来增加肝脏对 LDL 的摄取。
虽然这些药物已经被广泛使用，仍有相当一部分患者出现复发性心血管疾病，而且其 LDL 胆固醇水平也未能达到指南推荐目标。更重要的是，现有这些降胆固醇药物都不是通过直接促进胆固醇分解代谢或排泄来降低胆固醇。
胆固醇由 ABCG5 和 ABCG8 异二聚体排泄到胆汁和肠腔。ABCG5 或 ABCG8 突变会导致谷固醇血症，这是一种以甾醇累积和早发性动脉粥样硬化为特征的罕见疾病。在小鼠肝脏中过表达 ABCG5/G8 可增加肝胆胆固醇分泌并降低血浆胆固醇。
ABCG5/G8 的表达主要在转录水平受 LXR 调控。药理性激活 LXR 可通过上调 ABCG5/G8 增加胆固醇外排。然而，LXR 也会增加 SREBP1（又称 ADD1），后者驱动脂肪酸生物合成基因表达，导致有害的肝脂肪变性和高甘油三酯血症。因此，直接 LXR 激动剂并不适合临床治疗高胆固醇血症。
一项针对冰岛人的大规模遗传学研究发现，ASGR1 功能缺失变异与较低胆固醇水平和较低心血管疾病风险相关。ASGR1 是去唾液酸糖蛋白受体的主要亚型，是一种肝脏特异性受体，介导多种脱唾液酸糖蛋白的内吞和溶酶体降解。ASGR1 优先识别其糖链末端的半乳糖或 N-乙酰半乳糖胺。缺失 Asgr1 的小鼠表型总体正常，Asgr1 缺失所带来的降胆固醇作用也在小鼠和猪中得到复现。然而，ASGR1 究竟如何调控胆固醇代谢，仍不清楚。
Asgr1−/− 增加胆固醇外排
为揭示 ASGR1 功能缺失变异影响胆固醇代谢的机制，研究者在人肝癌细胞系 Huh7 中敲低 ASGR1，并进行了 RNA 测序。基因集富集分析（GSEA）显示，LXR 靶基因显著富集。RT-qPCR 证实，包括 ABCG5、ABCG8 和 ABCA1 在内的经典 LXR 靶基因表达升高。
有趣的是，在 ASGR1 敲低或敲除细胞中，LXRα 和 LXRβ 的蛋白水平升高。相反，过表达 ASGR1 则降低 LXRα、LXRβ 蛋白水平，以及 ABCG5、ABCG8 和 ABCA1 的 mRNA 水平。
ASGR1 在肝脏中高度表达。研究者构建了 Asgr1 缺失小鼠。杂合（Asgr1+/−）和纯合（Asgr1−/−）小鼠外观均基本正常。与野生型小鼠相比，Asgr1+/− 和 Asgr1−/− 小鼠血清总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平显著降低，并呈基因剂量依赖关系。Asgr1+/− 和 Asgr1−/− 小鼠肝脏 TC 和 TG 水平也低于野生型小鼠。
与此一致，Asgr1 缺失显著减少肝脏脂滴累积，且未造成肝损伤。值得注意的是，Asgr1 缺失小鼠胆囊中的胆汁体积增加，胆汁胆固醇和胆汁酸浓度也升高。与野生型小鼠相比，Asgr1+/− 和 Asgr1−/− 小鼠总胆汁胆固醇分别增加 71% 和 114%，总胆汁酸也升高。Asgr1−/− 小鼠胆汁呈浑浊状，提示胆汁胆固醇增加。
此外，Asgr1 缺失降低胆酸与鼠胆酸的比例，并使胆汁磷脂浓度略有升高。由于胆酸比鼠胆酸更能促进肠道胆固醇吸收，Asgr1 缺失小鼠胆汁酸组成的变化也可能有助于其较低胆固醇水平。
LXRα 是肝脏中占主导地位的 LXR 亚型，在 Asgr1−/− 肝脏中大幅升高。与此一致，Abcg5、ABCG8 和 CYP7A1 的表达增加，这解释了胆汁中胆固醇和胆汁酸水平升高，以及血清和肝脏脂质水平降低。
尽管 LXRα 升高，Asgr1−/− 肝脏中 SREBP1 前体（pre-SREBP1）、其核型形式（n-SREBP1）和脂肪酸合酶（FASN）的蛋白水平均明显下降。脂肪酸生物合成基因的 mRNA 水平也一致下调。进一步研究排除了 LDLR 和 HMGCR 蛋白水平、Dil-LDL 摄取或 PCSK9 促进 LDLR 降解的改变。Asgr1 缺失小鼠 LDL 清除未受损。TC 和 TG 分泌下降，可能是 Asgr1−/− 小鼠胆固醇排泄增加后的继发效应。Asgr1 缺失并未改变内源性 LXR 配体水平。雌性 Asgr1−/− 小鼠中也观察到类似的基因表达变化和代谢表型。
Asgr1−/− 的代谢获益需要 LXRα
为确定 Asgr1−/− 小鼠的代谢改善是否源于 LXRα 升高，研究者获得了 Asgr1−/−Lxrα−/− 小鼠。Asgr1−/− 肝脏中 ABCG8、ABCA1 和 CYP7A1 蛋白水平的升高，在缺失 Lxrα 后完全消失。
由于 LXRα 驱动 Srebp1c 转录，Lxrα−/− 小鼠中 SREBP1c、FASN、LDLR 和脂肪酸生物合成基因均下调。Lxrα 缺失小鼠中 Abcg5、Abcg8、Abca1 和 Cyp7a1 的 mRNA 水平下降；在缺乏 LXRα 的情况下，Asgr1 缺失无法增加这些基因的表达。
虽然各组小鼠体重、食物摄入和血糖水平相似，敲除 Lxrα 导致肝脏脂滴大量累积、肝细胞气球样变，以及 ALT 和 AST 升高。Asgr1 缺失显著降低肝脏脂质含量和血清 TC、TG，但这些效果在 Lxrα 消融后完全消失。
与野生型小鼠相比，Asgr1−/− 小鼠 VLDL 和 LDL 中的胆固醇含量明显下降，而 HDL 胆固醇水平升高。Lxrα 消融显著增加 VLDL 和 LDL 组分中的胆固醇，并抵消 Asgr1 缺失造成的脂质变化。与野生型相比，Asgr1−/− 小鼠总胆汁胆固醇增加约两倍，但在 Asgr1−/−Lxrα−/− 小鼠中降至基础水平。粪便胆固醇也在 Asgr1−/− 小鼠中增加 48%，这一现象被 Lxrα 缺失削弱。这些结果与 Abcg5、Abcg8 和 Abca1 的表达变化一致：ABCG5/G8 将胆固醇排入胆汁，随后通过粪便排出体外；ABCA1 则将胆固醇转运至 HDL。
LXRα 降解需要 BRCA1 和 BARD1
研究者随后考察 ASGR1 调控 LXRα 的机制。MG132 可阻断 ASGR1 诱导的 LXRα 降解。过表达 ASGR1 增加 LXRα 泛素化，而敲除 ASGR1 降低其泛素化。
由 BRCA1 和 BARD1 组成的 E3 泛素连接酶复合物可介导 LXRα 泛素化和降解。沉默 BRCA1 和 BARD1 显著削弱 ASGR1 促进的 LXRα 泛素化和降解。ASGR1 敲除或敲低降低 BRCA1 和 BARD1，并增加 LXRα。相反，ASGR1 以剂量依赖方式增加 BRCA1 和 BARD1。
ASGR1 敲除或过表达并不改变其他 BRCA1/BARD1 底物，如 cyclin B1 和 Cdc25C。Ki-67 和 PCNA 染色显示 Asgr1 缺失肝脏中没有异常细胞增殖，蛋白酶体亚基也未改变。综上，这些结果表明，Asgr1 缺失通过降低 BRCA1 和 BARD1，特异性增加 LXRα。
配体-ASGR1 通过 AMPK 调控 LXRα
ASGR1 是一种单跨膜蛋白，可结合血液中的多种去唾液酸糖蛋白。为检验配体-ASGR1 相互作用是否参与 LXRα 调控，研究者比较了有无胎牛血清时 ASGR1 促进 LXRα 降解的情况。在无血清培养基中，ASGR1 不能诱导 LXRα 降解。
去唾液酸胎球蛋白 A 或去唾液酸血清类黏蛋白是 ASGR1 的高亲和力天然配体。在无血清培养基且存在 ASGR1 时，它们可以剂量依赖性刺激 LXRα 降解。同时，去唾液酸胎球蛋白 A 与 ASGR1 协同增强 LXRα 泛素化。配体结合缺陷突变体 ASGR1(6A) 不能促进 LXRα 降解。
去唾液酸胎球蛋白 A 处理增加内源性 BRCA1 和 BARD1，并降低 LXRα。沉默 ASGR1 或 BRCA1/BARD1 使 LXRα 维持在较高水平，并消除去唾液酸胎球蛋白 A 诱导的 LXRα 降解。这些结果说明，去唾液酸糖蛋白结合 ASGR1 后增加 BRCA1/BARD1，从而促进 LXRα 降解。
血液中的去唾液酸糖蛋白通过肝脏 ASGR1 经网格蛋白介导的内吞进入细胞。内体中的酸性环境诱导 ASGR1 与糖蛋白解离，ASGR1 回收到质膜，而去唾液酸糖蛋白被递送至溶酶体降解。研究者进一步分析去唾液酸糖蛋白的内吞和溶酶体降解是否是 ASGR1 调控 LXRα 所必需。
沉默网格蛋白重链（CHC）消除 ASGR1 或去唾液酸胎球蛋白 A 诱导的 LXRα 降解。无论是否接受去唾液酸胎球蛋白 A 处理，CHC 沉默细胞中的 BRCA1 和 BARD1 水平均低于对照细胞。
溶酶体降解释放的糖和氨基酸等营养物质可以激活 mTORC1 并抑制 AMPK。mTORC1 激活 SREBP 和 USP20，促进脂质生物合成。相反，AMPK 抑制 SREBP 并下调 BRCA1。与这些发现一致，去唾液酸胎球蛋白 A 处理在对照细胞中激活 mTORC1 并抑制 AMPK。同时，去唾液酸胎球蛋白 A 增加 BRCA1 和 BARD1，并降低 LXRα。这些作用在 CHC 沉默细胞中消失。
Bafilomycin A1（BFA）通过升高溶酶体 pH 破坏溶酶体降解，从而抑制 mTORC1 并激活 AMPK。在 BFA 处理的野生型细胞中，BRCA1 和 BARD1 下降，LXRα 上升。BFA 也阻断 ASGR1 诱导的 LXRα 降解。ASGR1 缺失抑制 mTORC1、激活 AMPK，进一步导致 BRCA1 和 BARD1 降低以及 LXRα 升高；而 BFA 处理阻断 ASGR1 缺失对 mTORC1、AMPK、BRCA1/BARD1 或 LXR 的影响。
随后研究者检测 ASGR1 的作用是否依赖 AMPK。AMPK 激动剂 A769662 增加 LXRα 和 p-ACC，并降低 n-SREBP1、n-SREBP2、BRCA1 和 BARD1。AMPK 抑制剂 dorsomorphin 则产生相反效果。A769662 减弱 ASGR1 诱导的 LXRα 降解；相反，dorsomorphin 阻断 ASGR1 缺失诱导的 LXRα 增加。
为明确去唾液酸糖蛋白消化产生哪些营养物质调控 mTORC1，研究者快速分离溶酶体并直接测量氨基酸水平。去唾液酸胎球蛋白 A 处理增加野生型细胞溶酶体中大多数氨基酸水平，但在 ASGR1-KO 细胞中无此作用。转运蛋白 SLC38A9 对亮氨酸和其他氨基酸激活 mTORC1 是必需的。确实，去唾液酸胎球蛋白 A 以 SLC38A9 依赖方式增加 p-S6K。野生型 SLC38A9 可在 SLC38A9 敲除细胞中恢复 S6K 磷酸化，而影响 SLC38A9-Ragulator 相互作用或 SLC38A9 转运活性的突变不能恢复 S6K 磷酸化。
去唾液酸胎球蛋白 A 可使 mTOR 重新定位至溶酶体。白蛋白激活 mTORC1 的能力弱于去唾液酸胎球蛋白 A，提示 ASGR1 介导的糖蛋白摄取非常高效。
这些结果共同支持图 3h 所示的工作模型：ASGR1 结合去唾液酸糖蛋白，并通过网格蛋白介导的内吞将其递送至溶酶体。糖蛋白被消化后释放氨基酸，激活溶酶体 mTORC1 并抑制 AMPK。其结果是，一方面 SREBP 被激活并增加脂肪生成；另一方面 BRCA1 和 BARD1 表达增加，促进 LXRα 降解并降低胆固醇外排。通过这一过程，摄入的营养物质支持细胞生长。
当 ASGR1 突变或被抑制时，去唾液酸糖蛋白的内吞和溶酶体降解被阻断，导致 mTORC1 抑制和 AMPK 激活。AMPK 使 BRCA1/BARD1 不稳定，从而增加 LXRα，并上调包括 ABCA1 和 ABCG5/G8 在内的胆固醇转运蛋白。ABCA1 将胆固醇递送至 HDL，促进逆向胆固醇转运；ABCG5/G8 将胆固醇泵入胆汁，使胆固醇通过粪便排出。同时，激活的 AMPK 通过抑制 SREBP 抑制脂肪生成。综上，ASGR1 缺失可增加胆固醇外排，而不像泛 LXR 激动剂那样诱导脂肪生成。
Asgr1−/− 通过 AMPK 产生代谢获益
接下来，研究者设计了一系列动物实验进行体内验证。首先，向野生型小鼠静脉注射一次性大剂量去唾液酸胎球蛋白 A，导致肝脏中 p-S6K 和 p-4E-BP1 升高，提示 mTORC1 激活；同时 p-AMPK、p-Raptor、p-ACC 和 p-ULK1 降低，提示 AMPK 被抑制。BARD1 增加，LXRα 降低。与此一致，Abcg5、Abcg8、Abca1 和 Cyp7a1 表达下降。Srebp1c、Fasn 和 Scd1 mRNA 上调。肝脏和血清 TC、TG 明显增加，胆固醇和胆汁酸向胆汁的排泄大幅减少。
与此形成鲜明对比的是，Asgr1−/− 小鼠表现为 mTORC1 受抑、AMPK 激活、LXRα 增加、脂肪酸生物合成基因表达下降以及代谢谱改善，且这些表型不受去唾液酸胎球蛋白 A 注射影响。
其次，研究者使用 mTOR 抑制剂雷帕霉素模拟 Asgr1 缺失诱导的 mTORC1 抑制。雷帕霉素显著增加 p-AMPK、p-Raptor、p-ULK1 和 p-ACC，证实抑制 mTORC1 可激活 AMPK。同时，LXRα、ABCG5、ABCG8、ABCA1 和 CYP7A1 水平升高，而 FASN 水平下降，这与 AMPK 抑制 SREBP 通路一致。雷帕霉素降低血清和肝脏中的 TC、TG，并增加胆汁胆固醇、胆汁酸和粪便胆固醇。
第三，研究者通过靶向 AMPK 催化亚基亚型 Prkaa1 和 Prkaa2 的 AAV-shRNA，考察 AMPK 对 Asgr1 缺失诱导的代谢改善是否必需。AMPK 耗竭一致激活 mTORC1，并在很大程度上逆转 Asgr1 缺失肝脏中 LXRα、ABCA1、ABCG5、ABCG8 和 CYP7A1 的升高。肝脏 AMPK 耗竭增加血清和肝脏 TC、TG 水平。值得注意的是，AMPK shRNA 在野生型和 Asgr1−/− 小鼠中均降低胆汁胆固醇、胆汁酸以及粪便胆固醇。
最后，研究者使用 LXR 激动剂 GW3965 和 AMPK 激动剂 A769662，检验 AMPK 激活是否可抑制脂质生物合成，并区分 ASGR1 缺失与直接 LXR 激活。A769662 确实激活 AMPK 并随后抑制 mTORC1。它还降低 BARD1 并增加 LXRα，说明 AMPK 激活确实会升高 LXRα。此外，A769662 增加 ABCG8、ABCA1 和 CYP7A1。
单独或联合给予 GW3965 和 A769662 均降低血清和肝脏胆固醇水平，并增加胆固醇向胆汁和粪便的排泄，因为二者均可激活 LXR。由于 AMPK 抑制 SREBP，A769662 显著降低 Srebp2、Hmgcr、Srebp1c、Fasn 和 Scd1 mRNA。值得注意的是，GW3965 增加 LXR 靶基因表达，而联合 A769662 可降低 Srebp1c、Fasn 和 Scd1 mRNA，但不降低 Abcg5、Abcg8、Abca1 和 Cyp7a1 等其他 LXR 靶基因。GW3965 增加肝脏 TG，这是泛 LXR 激动剂的主要副作用；然而，与 A769662 联合给药后，肝脏 TG 较 GW3965 组下降 47.5%。总之，GW3965 与 A769662 联合给药可复现 Asgr1 缺失的基因表达和代谢表型。
抑制 ASGR1 的治疗潜力
RNA 抑制（RNAi）正成为一种有力的治疗方法。研究者使用 AAV-shRNA 在肝脏中沉默 Asgr1。LXRα、ABCG8、ABCA1 和 CYP7A1 蛋白水平显著升高，而 Srebp1c、Fasn 和 Scd1 mRNA 降低。Asgr1 敲低后，血清和肝脏中 TC、TG 水平显著下降。值得注意的是，注射 AAV-shAsgr1 的小鼠总胆汁胆固醇增加超过 1.4 倍，总胆汁酸也同步增加。AAV-shAsgr1 未改变体重，也未造成肝损伤。在 Ldlr−/− 小鼠中，敲低 Asgr1 显著预防高脂/高胆固醇/胆盐饮食诱导的动脉粥样硬化斑块形成和肝脏脂质沉积。
为进一步理解 ASGR1 抑制的治疗效果，研究者开发了抗 ASGR1 单克隆中和抗体。4B9-IgG 克隆以剂量依赖方式增加 LXRα，并上调 Abcg5 和 Abcg8 表达。4B9-IgG 识别 ASGR1 中位于糖识别结构域的区域（氨基酸 182-274）。
野生型和 Asgr1−/− 小鼠接受对照 IgG 或 4B9-IgG 腹腔注射。4B9-IgG 处理的野生型小鼠中 LXRα 显著增加，LXRβ 略有增加，ABCG8、CYP7A1 和 ABCA1 表达明显升高。4B9-IgG 激活 AMPK，并降低 SREBP1、FASN 和 BARD1。与此一致，4B9-IgG 在野生型小鼠肝脏中上调 Abcg5、Abcg8、Abca1 和 Cyp7a1 转录，并降低 Srebp1c、Fasn 和 Scd1 mRNA。在 Asgr1−/− 小鼠中，4B9-IgG 不改变 AMPK 激活或上述基因表达。
在野生型小鼠中，4B9-IgG 分别使血清 TC 和 TG 降低 50% 和 22%，肝脏 TC 和 TG 也显著下降。4B9-IgG 处理还使胆囊胆汁体积增加 62%，胆汁胆固醇浓度增加 67%，导致野生型小鼠总胆汁胆固醇增加超过一倍。对照 IgG 处理的野生型小鼠胆汁清澈，而 4B9-IgG 注射小鼠或 Asgr1−/− 小鼠胆汁不透明。4B9-IgG 处理的野生型小鼠粪便胆固醇增加约 87%。胆汁胆汁酸浓度和总胆汁酸也因 4B9-IgG 而增加。值得注意的是，4B9-IgG 不改善 Asgr1−/− 小鼠代谢谱，支持 4B9-IgG 的特异性。未检测到其他代谢改变或肝损伤。
抗 ASGR1 与他汀/依折麦布协同
研究者随后考察 4B9-IgG 是否与现有药物阿托伐他汀和依折麦布产生协同降脂作用。不论是否使用阿托伐他汀，4B9-IgG 都在野生型小鼠中激活 AMPK、增加 LXRα、上调 Abcg5、Abcg8、Abca1 和 Cyp7a1 表达，并降低 Srebp1c、Fasn 和 Scd1 表达。
单独使用 4B9-IgG 或阿托伐他汀均可相似地降低野生型小鼠 TC 和 TG。体重和其他代谢参数相似。值得注意的是，4B9-IgG 与阿托伐他汀联合给药显著降低野生型小鼠血清和肝脏脂质水平。Asgr1−/− 小鼠 TC 和 TG 水平远低于野生型小鼠。阿托伐他汀可进一步降低血清脂质水平，而 4B9-IgG 在 Asgr1−/− 小鼠中无效。与图 4 结果一致，无论是否使用阿托伐他汀，4B9-IgG 均显著增加野生型小鼠总胆汁胆固醇、总胆汁酸和粪便胆固醇。单独阿托伐他汀对胆汁胆固醇、胆汁酸或粪便胆固醇水平无影响。
最后，研究者用 4B9-IgG 和依折麦布处理小鼠。在野生型小鼠中，无论是否存在依折麦布，4B9-IgG 均以阻断 ASGR1 的方式发挥作用。4B9-IgG 与依折麦布协同降低野生型小鼠血清和肝脏中的 TC、TG，尽管单独处理也能改善脂质谱。在 Asgr1−/− 小鼠中，依折麦布仍可降低血清和肝脏中的脂质含量，而 4B9-IgG 无效。依折麦布显著降低野生型小鼠总胆汁胆固醇，因为它抑制膳食胆固醇吸收。即使合用依折麦布，4B9-IgG 仍可增加野生型小鼠总胆汁胆固醇和胆汁酸。
讨论
mTORC1 和 AMPK 是两个感知细胞营养状态并控制代谢的主调控因子。它们通过多种机制反向调控。虽然 AMPK 被认为可能成为代谢疾病治疗靶点，但泛 AMPK 激动剂会导致心脏肥大，限制其临床应用。除 AMPK 激活的组织特异性作用外，细胞内 AMPK 还存在区室化，并受药物、营养可用性和 AMP 的差异调控，从而导致不同靶标被磷酸化。因此，在药物开发中，选择性 AMPK 激活对获得代谢获益并避免不良反应至关重要。
本文揭示 mTORC1 和 AMPK 可受 ASGR1 调节。去唾液酸糖蛋白经 ASGR1 介导的内吞进入肝细胞，其溶酶体消化释放的氨基酸激活 mTORC1。从概念上看，这一发现与此前关于自噬或巨胞饮产生的溶酶体氨基酸可激活 mTORC1 的认识一致。抑制 ASGR1 可阻断受体介导的去唾液酸糖蛋白内化及随后的溶酶体消化，从而激活 AMPK 并抑制 mTORC1。这一机制提供了一种高度局部化的信号，可实现选择性 AMPK 激活。
胆固醇外排通过 LXRα 和 ABCG5/G8 增加。由于 ABCA1 被 LXRα 上调，脂蛋白谱也得到改善，表现为 HDL 胆固醇升高、LDL 胆固醇降低。作为 mTORC1 抑制和 AMPK 激活的结果，SREBP1 被抑制，从而防止脂肪生成。此外，Ttc39b 消融可增加 LXRα 和 ABCG5/G8 而不激活 SREBP1，这也证实 ABCG5/G8 表达可与 SREBP1 表达脱耦。由于 ASGR1 几乎只在肝细胞中表达，靶向 ASGR1 为肝脏特异性激活 AMPK 和抑制 mTORC1 开辟了路径，可绕开泛 AMPK 激动剂的不良副作用。
在治疗高血糖的药物中，钠-葡萄糖协同转运蛋白 2（SGLT2）抑制剂通过阻断肾脏葡萄糖重吸收，促进葡萄糖经尿液排泄。这些抑制剂产生多重有益作用，主要是因为它们促使肾脏将葡萄糖移出体外。胆固醇是一种带有四环结构的脂质，难以分解，并且是强促炎分子，可加速动脉粥样硬化和非酒精性脂肪性肝炎。抑制 ASGR1 可增加胆固醇向胆汁和随后向粪便的排泄，为降低胆固醇提供了一种独特方式。事实上，ASGR1 功能缺失变异已被发现与较低非 HDL 胆固醇和较低心血管疾病风险相关，这提示 ASGR1 抑制是一种安全有效的心血管疾病治疗方式。
在线内容
任何方法、额外参考文献、Nature Research 报告摘要、源数据、扩展数据、补充信息、致谢、同行评议信息；作者贡献和利益冲突声明；数据和代码可用性声明，均可在 https://doi.org/10.1038/s41586-022-05006-3 获取。
方法
小鼠
Asgr1 敲除小鼠由 CRISPR-Cas9 系统生成。单导 RNA（sgRNA）和供体共同注射入 C57BL/6J 合子。sgRNA 引导 Cas9 核酸内切酶在内含子 2-3 和内含子 8-9 中切割，如扩展数据图 1 所示。LXRα 敲除小鼠由中国科学院上海营养与健康研究所尹慧勇馈赠。
C57/B6J 小鼠（6-8 周龄）购自 GemPharmatech 和湖北省疾控中心。图注所述实验使用了雌雄小鼠。C57/B6J Ldlr−/− 小鼠购自 GemPharmatech。Asgr1+/− 杂交产生的野生型同窝小鼠作为动物实验对照。为生成 Asgr1−/−Lxrα−/− 双敲除小鼠，将 Asgr1+/− 与 Lxrα+/− 小鼠杂交。所有小鼠饲养于 SPF 环境，温度 22 ± 1 °C，相对湿度 50-60%，光照周期为 06:00-18:00。处理前所有动物均维持普通饲料。按图注所述，年龄匹配小鼠给予高脂/高胆固醇/胆盐饮食。处死前所有小鼠禁食 4 小时。由于研究者必须执行相应操作，无法对实验者实施盲法。小鼠随机分配至不同组，并尽可能接受等同处理。没有数据被排除。所有动物操作均经武汉大学动物护理与使用委员会批准。
材料和质粒
MG132 购自 Boston Biochem；dorsomorphin 2HCl（AMPK 抑制剂）和 A769662（AMPK 激活剂）购自 Target Molecule；bafilomycin A1 购自 MCE；洛伐他汀购自上海 Pharm Valley；甲羟戊酸和胎球蛋白 A 购自 Sigma；EZ18D03841 购自 Steroloids；阿托伐他汀购自 Energy Chemical；Dil-LDL 购自 Yeasen；血清类黏蛋白购自 Abcam；PMSF 购自 Thermo Scientific；雷帕霉素和 GW3965 购自 Topscience；poloxamer 407 购自 Sigma；放射性胆固醇油酸酯购自 Perkin Elmer；DOPC 和 DAB 底物试剂盒分别购自 Sigma 和 Abcam。脂蛋白缺乏血清（LPDS）由新生牛血清在本实验室经超速离心制备。
研究者使用标准分子克隆方法构建了多种质粒。pCMV-ASGR1-3×FLAG 编码带表位标签的全长小鼠 Asgr1。pCMV-EGFP-LXRα 和 pCMV-5×MYC-LXRα 分别编码带 EGFP 或 5×MYC 表位标签的小鼠 LXRα。pEF-HA-Ubi 编码带 HA 表位标签的人 Ubi。pCMV-BARD1-5×MYC 和 pCMV-LDLR-5×MYC 分别编码带 5×MYC 表位标签的人 BARD1 和小鼠 LDLR。ASGR1 截短质粒和 pCMV-ASGR1(6A)-3×FLAG 均通过 QuikChange 构建。pCMV-EGFP-BRCA1 来自 Addgene（编号 71116）。TMEM192 编码区从 Huh7 细胞 cDNA 扩增并连接至 pCMV14-3×FLAG 载体，随后亚克隆至 pLVX-IRES-puro。野生型和突变型 SLC38A9 cDNA 由同济大学王鹏提供并亚克隆至 pLVX-IRES-puro。
细胞培养
Huh7 和 HEK293T 细胞在 37 °C、5% CO2 条件下培养。Huh7 和 HEK293T 细胞使用 Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）培养，培养基含 100 units/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素和 10% FBS。原代小鼠肝细胞从普通饲料喂养的 8 周龄雄性 C57BL/6J 小鼠新鲜分离，并在含 5% FBS、100 units/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素的 Medium 199 中培养。胆固醇耗竭培养基为含 5% LPDS、1 μM 洛伐他汀和 10 μM 甲羟戊酸钠的 DMEM。
细胞系构建
ASGR1 KO 细胞（ASGR1 KO-A、KO-B）使用 CRISPR-Cas9 基因组编辑系统构建。简言之，人 ASGR1 靶向 sgRNA（序列：5'-CTGAAGGTCTTGATACTCCT-3'）克隆入 pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 载体（#42230，Addgene），随后与 pLKO.1 共转染 Huh7 细胞。转染 8 小时后，细胞在含 10% FBS 和 2 μg/ml 嘌呤霉素的 DMEM 中培养，直至形成单克隆。
稳定表达 ASGR1 的 Huh7 细胞（ASGR1 OE-A、OE-B）按既往方法生成。简言之，用 FuGENE HD 瞬时转染 pCMV-ASGR1-3×Flag。8 小时后更换为含 10% FBS 和 400 μg/ml G418 的 DMEM。每 2 天更换培养基，直至形成单克隆。预验证 guide RNA 序列合成后连接入 pX330 载体（GGCTCAAACTGGATATTCATAGG）。Huh7 细胞与 pX330 和提供嘌呤霉素抗性的 pLKO.1 共转染。细胞用 5 μg/ml 嘌呤霉素筛选 48 小时，然后以每孔 0.8 个细胞的密度接种到 96 孔板中，培养 2 周。SLC38A9 敲除通过免疫印迹确认。
泛素化检测
Huh7 细胞在第 0 天以 6 × 10^5 个细胞密度接种于 6 cm 培养皿中，按图注进行质粒转染和处理。48 小时后，细胞用预冷 PBS 清洗，并用免疫沉淀缓冲液裂解。裂解液在 4 °C、14,000g 离心 20 分钟。随后上清与 anti-FLAG M2 琼脂糖珠在 4 °C 孵育 4 小时。
对于内源性 LXR 的泛素化检测，裂解液先在 4 °C 下与抗 LXR 抗体和 protein A/G 琼脂糖珠免疫沉淀 2 小时。珠子随后用含蛋白酶抑制剂的免疫沉淀缓冲液清洗三次（排除 PMSF 和 DTT），再用不含 β-巯基乙醇的上样缓冲液在 95 °C 煮沸 10 分钟。收集样品并进行 western blot 分析。
Dil-LDL 内吞
siRNA 介导的 ASGR1 敲低细胞（siASGR1）和对照细胞（siCtrl）在第 0 天接种于玻片上。收获前，细胞在 4 °C 下用胆固醇耗竭培养基孵育 30 分钟，再转入含 10 μg/ml Dil-LDL 的新鲜胆固醇耗竭培养基中，于 4 °C 孵育 1 小时。PBS 清洗两次后，切换至 37 °C，加入新鲜胆固醇耗竭培养基，并在指定时间点收获。最后，细胞用 4% 多聚甲醛固定、PBS 清洗，并在 Leica SP8 共聚焦显微镜下成像。内吞 Dil-LDL 的荧光强度按既往方法用 ImageJ 定量。
RNA-seq 和 GSEA
Huh7 细胞转染乱序 siRNA（siCtrl）或 ASGR1 靶向 siRNA（siASGR1），每组 3 个生物学独立重复。72 小时后收获细胞提取 RNA，并将样品分别命名为 WT 和 AS2。随后对这些样品进行 RNA-seq，并按软件说明使用 GSEA 进行分析。简言之，研究者自定义了 GO pathway 的 C5 子集，并从已发表数据中选择 LXR 靶基因作为新子集。最终获得富集分数（ES）、|NOM|、P 值等数据，并用 Prism v9.0 导出折线图。
AAV2/8 介导的基因表达和敲低
AAV 克隆载体 AAV-shRNA 和 pAKD-CMV-bGlobin-EGFP-H1-shRNA 分别来自 Obio Technology 和 PackGene Biotech（广州）。AAV2/8-shControl、AAV2/8-shAsgr1、AAV2/8-shAMPKα1 和 AAV2/8-shAMPKα2 通过将相应 shRNA 克隆入 pAKD-CMV-bGlobin-EGFP-H1-shRNA 制备。所用序列包括对照 shRNA、ASGR1 shRNA、AMPKα1 shRNA 和 AMPKα2 shRNA。小鼠使用 29G 胰岛素注射器经尾静脉注射 AAV8。
去唾液酸糖蛋白制备
胎球蛋白 A 和血清类黏蛋白按既往方法脱唾液酸。简言之，将糖蛋白置于 0.1 mol/l HCl 三氟乙酸中，80 °C 处理 2 小时。
溶酶体快速纯化
表达 TMEM192-3×FLAG 或对照慢病毒的颗粒在 HEK293T 细胞中产生。病毒上清用于转导 Huh7 细胞，加入 8 μg/ml polybrene 处理 24 小时。细胞用 5 μg/ml 嘌呤霉素筛选 48 小时，并在 2 μg/ml 嘌呤霉素存在下维持培养。通过抗 FLAG 染色确认转导效率超过 95%。
对照或 TMEM192-3×FLAG 过表达 Huh7 细胞接种于 10 × 10 cm² 培养皿中，并生长至接近汇合。细胞用 EBSS 清洗两次，在含 5 mM 葡萄糖的 EBSS 中孵育 2 小时，随后加入去唾液酸胎球蛋白 A（30 μg/ml，2 小时）。细胞用冰冷 KPBS 清洗两次，刮取并收集。细胞沉淀重悬于 1 ml KPBS 中，并用 Dounce 匀浆器裂解。细胞裂解液与 30 μl 抗 FLAG 磁珠在冰上旋转孵育 3 分钟。磁珠用 KPBS 清洗五次，并用 0.5% SDS（用于免疫印迹）或 80% 甲醇（用于氨基酸定量）洗脱。
代谢组学分析
从溶酶体提取代谢物时，将结合溶酶体的磁珠重悬于 200 μl 冰冷代谢物提取缓冲液（80% 甲醇、20% 水，含内标）中，涡旋 30 秒。混合物在液氮中冷冻、室温解冻，重复三次。样品超声 10 分钟，并在 4 °C、13,000 r.p.m. 离心 15 分钟。上清转移到干净管中，取 50 μl 上清用于 Amplex Red 法胆固醇定量。剩余上清用 speedvac 完全浓缩干燥。代谢物残渣重新溶解于 50% 乙腈中，并用 Waters Acquity UPLC 系统联用 SCIEX 5500 QTRAP 系统进行超高效液相色谱-串联质谱分析。
色谱分离使用 Waters Acquity UPLC BEH Amide 柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm），流速 0.4 ml/min，温度 40 °C，15 分钟梯度洗脱。缓冲液 A 为水、10 mM 甲酸铵和 0.15% 甲酸；缓冲液 B 为 99% 乙腈、1% 水、2 mM 甲酸铵和 0.15% 甲酸。质谱以正离子模式和电喷雾离子源运行。分析物检测采用多反应监测。峰识别和面积积分使用 Analyst v1.7.1 和 SCIEX OS 1.4.0。胆固醇定量用于归一化。
VLDL 分泌实验
10 周龄雄性野生型和 Asgr1−/− 小鼠给予高脂/高胆固醇/胆盐饮食 2 天。随后小鼠禁食 4 小时，并腹腔注射 1 g/kg 体重的 poloxamer 407（PBS 中）。按指定时间点 0、0.5、1、2、3、4 和 5 小时采血，并用上海科华生物工程公司 TC 和 TG 试剂盒测定。
脂蛋白清除实验
人 LDL 从健康供者血浆中通过连续超速离心分离。研究者制备了 ^3H-胆固醇油酸酯标记脂质体。约 200 μCi ^3H-胆固醇油酸酯加入溶解于氯仿的 15 mg DOPC 中并蒸干。加入 1 ml PBS 重悬脂质，随后在液氮和 37 °C 水浴之间进行 5 次冻融循环。随后使用 mini-extruder 挤出技术制备脂质体。^3H-胆固醇油酸酯被掺入 LDL。简言之，将 LDL（2.5 mg/ml，10 ml）在 37 °C 下持续振荡 24 小时以促进交换。随后经密度梯度离心重新分离 ^3H-胆固醇油酸酯标记 LDL，并在含 150 mmol/l NaCl 的缓冲液中于 4 °C 透析，再定量每分钟衰变数（DPM）。
10 周龄野生型和 Asgr1−/− 小鼠给予高脂/高胆固醇/胆盐饮食 2 天。随后禁食 17 小时并复喂 6 小时。放射性标记 LDL 用 PBS 稀释后静脉注射入小鼠（每只小鼠 5 × 10^5 dpm，总体积约 200 μl）。在 0 和 30 秒，以及 20、40、60、80、100 和 120 分钟采样。取 5 μl 血浆用闪烁计数仪计数。
免疫组织化学
制备 p53−/− 和 Ptch1+/− 髓母细胞瘤、野生型小鼠和 Asgr1−/− 小鼠的石蜡切片。切片在 37 °C 复温 15 分钟，随后用新鲜二甲苯洗涤 15 分钟，重复三次。随后用 50% 二甲苯和 50% 乙醇刷新缓冲液 15 分钟，并用乙醇清洗两次。切片在浸入双蒸水前，分别用 95%、80%、70%、50% 和 30% 乙醇梯度洗脱，每步 5 分钟。切片置于 pH 6.0 柠檬酸钠缓冲液中煮沸 15 分钟，并用双蒸水清洗三次，每次 5 分钟。随后用 3% H2O2（甲醇稀释）灭活过氧化物酶 10 分钟，用双蒸水清洗两次，每次 5 分钟，再置于 PBS 缓冲液 5 分钟。样品用 10% 山羊血清（PBS 稀释）室温封闭 30 分钟，随后覆盖指定浓度的一抗过夜。第二天，切片用 PBS 清洗三次，每次 5 分钟，并在室温下与二抗孵育 1 小时。随后用 DAB 底物试剂盒显色，用苏木精核染 4 分钟。最后，样品用流水冲洗，并依次置于 75%、85%、95% 和 100% 乙醇中 2-3 秒，随后用 100% 乙醇脱水，冲洗两次，每次 1 分钟，封片后在荧光显微镜下观察。
动脉粥样硬化病变分析
分离小鼠主动脉树，并用 4% 多聚甲醛固定。Sudan IV 染色前去除多余血管周围脂肪组织。随后用 Sudan IV 染色 10 分钟，用 70% 乙醇洗涤 3 分钟，再用 70% 乙醇每次 1.5 分钟清洗两次，然后成像。
siRNA 敲低
基因特异性 siRNA 由广州锐博生物设计合成。siRNA 按厂家说明使用 Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂分别转染入细胞。序列如下：
- siASGR1-A:
5'-GAGCAGAAAUUUGUCCAGCACCACA-3' - siASGR1-B:
5'-GGUUGUCUGUGUGAUCGGAUCCCAA-3' - siASGR2:
5'-GGUCUGCUUCAGUCUGCUU-3' - siBARD1:
5'-GCUGCUCGCGUUGUACUAA-3' - siBRCA1:
5'-CAGCAGUUUAUUACUCACUAA-3' - siCHC-1:
5'-CCGGAAAUUUGAUGUCAAUACUUCA-3' - siCHC-2:
5'-GAGUGCUUUGGAGCUUGUCUGUUUA-3' - siControl:
5'-GTAAATCTATGTCGGAACCATCTTA-3'
免疫印迹
细胞或肝组织用 RIPA 缓冲液裂解，缓冲液含 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、150 mM NaCl、2 mM MgCl2、1.5% NP-40、0.1% SDS 和 0.5% sodium deoxycholate，并加入蛋白酶抑制剂 cocktail。蛋白浓度用 BCA 试剂盒测定。样品与上样缓冲液混合，并在 37 °C 孵育 30 分钟。蛋白经 SDS-PAGE 分离，转移至 PVDF 膜，并进行 western blot 分析。
研究中使用的抗体包括：anti-FLAG（M2，Sigma F1804，1:1,000）、anti-beta-actin（AC-15，Sigma A1978，1:10,000）、anti-p-ACC、anti-p-AMPKα、anti-p70 S6 Kinase、anti-p-ULK1、anti-p-Raptor、anti-p-4E-BP1、anti-4E-BP1、anti-ULK1、anti-Raptor、anti-ACC、anti-AMPKα1、anti-AMPKα2、anti-cyclin B1、anti-CDC25C、anti-PSMA7、anti-PSMA3、anti-PSMB7、anti-PSMB5、anti-PRN11、anti-RPT6、anti-Ki-67、anti-PCNA、anti-LXRα、anti-LXRβ、anti-SREBP1、anti-SREBP2、anti-BARD1、anti-BRCA1、anti-ABCG8、anti-ABCG5、anti-ABCA1、anti-CYP7A1、anti-FASN、anti-ASGR1、anti-GAPDH、anti-Ubi、anti-clathrin heavy chain 等。anti-Myc、anti-HMGCR、anti-SREBP2 等抗体由本实验室从杂交瘤细胞系 9E10、A9 和 1D2 中制备和纯化。rabbit polyclonal anti-HMGCR、anti-LDLR 和 anti-EGFP 抗体也由本实验室制备，并已用于此前发表的论文。研究还使用了 Jackson ImmunoResearch Laboratories 的 HRP 标记山羊抗小鼠 IgG 二抗和山羊抗兔 IgG 二抗。单克隆抗 ASGR1 中和抗体的开发流程由武汉 Dia-An Biotechnology Company 完成，见扩展数据图 10a。
RT-qPCR
使用 Trizol Reagent 从单只小鼠肝组织或 6 cm 培养皿中培养的细胞提取总 RNA。纯化总 RNA 用 RNase-free DNase I 处理，以去除提取物中的基因组 DNA。使用 M-MLV Reverse Transcriptase 对 2 μg 总 RNA 进行逆转录。定量 PCR 在 Bio-Rad CFX384 或 Bio-Rad CFX96 上进行，使用 Hieff qPCR SYBR Green Master Mix。RNA 表达水平采用 ΔΔCt 方法计算。引物序列见补充表 2。
生化检测
血糖从尾静脉血用 Onetouch UltraEasy 血糖监测系统测量。全血样本从每只小鼠眶后静脉丛采集。采集后血液在室温凝固 30 分钟，并在 1,500g 离心 10 分钟后分离血清。血清 TC 和 TG 用上海科华生物工程公司 TC 和 TG 试剂盒测定。
肝脏脂质先用甲醇-氯仿（2:1，v/v）提取，肝脏 TC 和 TG 含量用商业试剂盒测定。循环 ALT 和 AST 用南京建成生物工程研究所商业试剂盒测定。胆囊胆汁从禁食 4 小时小鼠中收集，胆汁体积用 p10 移液器吸头估算。测定胆汁浓度时，将 5 μl 胆汁与 45 μl Milli Q 水充分混合，再用 200 μl 氯仿/甲醇（2:1）提取。分离有机相和水相，干燥后分别溶于乙醇和 Milli Q 水。有机相用 TC kit 和 TBA kit 测定。胆汁磷脂用 WAKO LabAssay 商业试剂盒测定。
粪便样本从单笼饲养小鼠中连续 3 天收集，随后冻干并称重。粪便总胆汁酸用甲醇提取，粪便脂质用甲醇-氯仿（2:1，v/v）提取。所有数据由 Microplate Manager v6（SoftMax Pro v7.1）读取。
统计分析
未使用统计方法预先确定样本量。样本量根据既往发表研究和统计要求确定。n 值代表体内实验中的单只小鼠。所有动物实验和体外检测至少在两个独立实验中重复。所有重复尝试均成功。所有数据表示为均值 ± s.e.m.。统计分析使用 GraphPad Prism v9 或 Microsoft Excel 2020，根据图注采用单因素 ANOVA 后 Tukey 检验、非配对双尾 Student t 检验，或双因素 ANOVA 后 Šídák 多重比较检验。P < 0.05 认为具有统计学意义。
Reporting summary
更多研究设计信息可见本文链接的 Nature Research Reporting Summary。
数据可用性
所有免疫印迹源数据见补充图 1。图 1、2、4、5 和扩展数据图 1、2、4-12 的其他源数据随本文提供。支持本研究发现的二代测序数据已存入 NCBI Gene Expression Omnibus（GEO），登录号为 GSE183013。
图注
图 1 | Asgr1 缺失增加 LXRα 和胆固醇排泄，并降低脂质水平
a，GSEA 显示 LXR 靶基因富集。Huh7 细胞转染乱序 siRNA（siCtrl）或 ASGR1 靶向 siRNA（siASGR1）。提取 RNA 后进行深度测序和 GSEA。b，RT-qPCR 分析 mRNA 相对量（每组 n = 3 个生物学独立样本）。Huh7 细胞转染指定 siRNA。c，免疫印迹分析，细胞处理同 b。d，野生型和两个 ASGR1 敲除 Huh7 细胞（ASGR1 KO-A、KO-B）的免疫印迹分析。e，对野生型 Huh7 细胞和稳定表达 ASGR1 的 Huh7 细胞（ASGR1 OE-A、OE-B）进行免疫印迹分析。c-e 实验按所示条件重复三次，结果相似。f，RT-qPCR 分析（每组 n = 3 个生物学独立样本）。g-s，8 周龄雄性 Asgr1+/−、Asgr1−/− 小鼠和野生型雄性同窝小鼠随机分组（每组 n = 6），给予高脂/高胆固醇/胆盐饮食 4 周。g，血清 TC。h，血清 TG。i，肝脏 TC。j，肝脏 TG。k，小鼠肝切片 H&E 和 Oil Red O 染色，比例尺 50 μm。l，胆囊胆汁体积。m，胆汁胆固醇浓度。n，胆汁胆汁酸浓度。o，总胆汁胆固醇。p，总胆汁胆汁酸。q，胆汁代表图像。r，肝样本免疫印迹分析。s，RT-qPCR 测量小鼠肝脏基因表达。所有数值为均值 ± s.e.m.。P 值通过非配对双尾 Student t 检验（b、f）或单因素 ANOVA 后 Tukey 检验（g-j、l-p、s）计算。
图 2 | Asgr1−/− 小鼠的代谢改善依赖 LXRα
所有动物由 Asgr1+/−Lxrα+/− 小鼠杂交产生。8 周龄雄性小鼠随机分组（每组 n = 6），给予高脂/高胆固醇/胆盐饮食 6 周。a，肝样本免疫印迹分析。b，血清 TC。c，血清 TG。d，肝脏 TC。e，肝脏 TG。f、g，脂蛋白谱分析。f，Asgr1+/+Lxrα+/+ 和 Asgr1−/−Lxrα+/+ 的局部放大。g，四组小鼠脂蛋白谱分析。h，总胆汁胆固醇。i，粪便胆固醇。所有数值为均值 ± s.e.m.。P 值通过非配对双尾 Student t 检验计算。
图 3 | 去唾液酸糖蛋白-ASGR1-AMPK/mTORC1 轴调控 LXRα 和 SREBP
a，Huh7 细胞转染乱序 siRNA 或靶向 BRCA1 和 BARD1 的 siRNA（siBA1+BD1），以及 LXRα、Ubi 和 ASGR1 表达质粒。收获前用 MG132 处理。b，Huh7 细胞转染 LXRα、Ubi 和 ASGR1 表达质粒。细胞在无血清培养基中用去唾液酸胎球蛋白 A 处理 3 小时，再用 MG132 处理 5 小时。c，Huh7 细胞转染 siRNA，并在无血清培养基中用去唾液酸胎球蛋白 A 处理。d，Huh7 细胞转染乱序 siRNA 或靶向 CHC 的 siRNA，处理同 c。e，Huh7 和 ASGR1 KO 细胞用 20 nM bafilomycin A1 处理 2 小时。f，Huh7 细胞用 A769662（0、30、100 μM）处理 5 小时。g，Huh7 和 ASGR1 KO 细胞先用含 0 mM 葡萄糖的培养基预处理 4 小时，再用 10 nM dorsomorphin 处理 5 小时。a-g 实验按所示条件重复两次，结果相似。h，ASGR1 调控机制模型。
图 4 | 抗 ASGR1 中和抗体促进胆固醇排泄
8 周龄雄性 Asgr1−/− 小鼠和野生型雄性同窝小鼠随机分组（每组 n = 6），给予高脂/高胆固醇/胆盐饮食。小鼠每隔一天腹腔注射 10 mg/kg/d 对照 IgG 或抗 ASGR1 中和抗体（4B9-IgG），持续 14 天。a，肝样本免疫印迹分析。b，血清 TC。c，血清 TG。d，肝脏 TC。e，肝脏 TG。f，胆囊胆汁体积。g，胆汁胆固醇浓度。h，总胆汁胆固醇。i，胆汁代表图像。j，粪便胆固醇。k，胆汁胆汁酸浓度。l，总胆汁酸。所有数值为均值 ± s.e.。P 值通过非配对双尾 Student t 检验计算。
图 5 | 抗 ASGR1 与阿托伐他汀和依折麦布具有协同降脂作用
a-h，8 周龄雄性 Asgr1−/− 小鼠和野生型雄性同窝小鼠随机分组（每组 n = 6），给予高脂/高胆固醇/胆盐饮食。小鼠每日灌胃载体或 30 mg/kg/d 阿托伐他汀，并每隔一天腹腔注射 10 mg/kg/d 对照 IgG 或 4B9-IgG，持续 14 天。a，肝样本免疫印迹分析。b，血清 TC。c，血清 TG。d，肝脏 TC。e，肝脏 TG。f，总胆汁胆固醇。g，总胆汁酸。h，粪便胆固醇。i-p，8 周龄雄性 Asgr1−/− 小鼠和野生型雄性同窝小鼠随机分组（每组 n = 6），给予高脂/高胆固醇/胆盐饮食。小鼠每日灌胃载体或 10 mg/kg/d 依折麦布，并每隔一天腹腔注射 10 mg/kg/d 对照 IgG 或 4B9-IgG，持续 8 天。i，肝样本免疫印迹分析。j，血清 TC。k，血清 TG。l，肝脏 TC。m，肝脏 TG。n，总胆汁胆固醇。o，总胆汁酸。p，肝切片 Oil Red O 染色，比例尺 50 μm。所有数值为均值 ± s.e.m.。P 值通过非配对双尾 Student t 检验计算。凝胶和 blot 在严格对照下并行处理。
扩展数据图注
扩展数据图 1 | Asgr1−/− 小鼠表征及 ASGR1 对脂质代谢影响分析
a，小鼠 ASGR1 蛋白的组织分布。b，Asgr1 敲除小鼠构建示意图。c，Asgr1+/+、Asgr1+/− 和 Asgr1−/− 小鼠 DNA 分型。d，肝裂解液免疫印迹。e-l、n，小鼠同图 1g-s（每组 n = 6）。e，体重。f，食物摄入。g，肝体比。h，血糖。i，血清 AST。j，血清 ALT。k，胆汁磷脂。l，胆汁胆固醇/磷脂比。m，8 周龄雄性 Asgr1−/− 小鼠及野生型雄性同窝小鼠随机分组（每组 n = 8），给予高脂/高胆固醇/胆盐饮食 4 周，检测胆酸与鼠胆酸比。n，肝组织裂解液免疫印迹。o，Huh7 细胞和 ASGR1 缺失 Huh7 细胞更新为含 10% FBS 的 DMEM 或胆固醇耗竭培养基 16 小时，随后在胆固醇耗竭培养基中用指定浓度 25-羟基胆固醇处理 5 小时。p，Huh7 细胞和稳定表达 ASGR1 的 Huh7 细胞按 o 处理。q，Huh7 细胞转染乱序 siRNA 或靶向 ASGR1/ASGR2 的 siRNA，转染 56 小时后切换培养基，16 小时后收获、裂解并进行免疫印迹。r，Huh7 细胞转染指定质粒，32 小时后切换培养基，16 小时后收获、裂解并进行免疫印迹。s，沉默 ASGR1 不影响 Dil-LDL 摄取。t，对 s 中内吞 Dil-LDL 进行定量。u，沉默 ASGR1 不改变 PCSK9 诱导的 LDLR 降解。v，LDL 清除实验。w-x，VLDL 分泌实验。所有数值为均值 ± SEM。
扩展数据图 2 | 雌性 Asgr1−/− 小鼠表征
a-o，8 周龄雌性 Asgr1−/− 小鼠及野生型雌性同窝小鼠随机分组（每组 n = 6），自由摄水并给予高脂/高胆固醇/胆盐饮食 5 周。a，肝组织裂解液免疫印迹。b，RT-qPCR 测定肝脏基因 mRNA 水平。c，体重。d，肝体比。e，血清 TC。f，血清 TG。g，肝脏 TC。h，肝脏 TG。i，血清 ALT。j，血清 AST。k，胆囊胆汁体积。l，胆汁胆固醇浓度。m，总胆汁胆固醇。n，胆汁胆汁酸浓度。o，总胆汁酸。p-z，使用图 2 所示同批小鼠（每组 n = 6）。p，RT-qPCR 分析肝脏 mRNA 相对量。q，肝体比。r，肝切片 H&E 和 Oil Red O 染色，比例尺 50 μm。s，体重。t，食物摄入。u，血糖。v，血清 ALT。w，血清 AST。x，胆汁胆固醇浓度。y，胆汁胆汁酸浓度。z，胆囊胆汁体积。
扩展数据图 3 | ASGR1 调控 LXRα 降解的机制
a，Huh7 细胞转染指定质粒，转染 43 小时后切换至含 10 μM MG132 的培养基。b，Huh7 细胞和稳定表达 ASGR1 的 Huh7 细胞在 37 °C 培养 43 小时，随后用 10 μM MG132 处理 5 小时。裂解液用偶联抗 LXRα 的琼脂糖免疫沉淀以拉下 LXRα，输入和沉淀组分用抗泛素、抗 LXRα 和抗 ASGR1 抗体检测。c，Huh7 细胞和 ASGR1 缺失 Huh7 细胞按 b 处理。d，Huh7 细胞转染对照 siRNA 或靶向 BRCA1/BARD1 的 siRNA，12 小时后转染指定质粒，48 小时后收获免疫印迹。e-i，检测 ASGR1 敲除、敲低或过表达对相关蛋白的影响。j，野生型和 Asgr1−/− 雄性小鼠肝切片 Ki-67 和 PCNA 免疫组化，以雄性 p53−/− & Ptch1+/− 髓母细胞瘤样本为阳性对照。k-l，检测 ASGR1 KO 或 ASGR1 OE 细胞。m，小鼠 ASGR1-配体复合物示意图，标明胞质区、跨膜结构域、柄区和糖识别结构域。n-r，检测血清、去唾液酸胎球蛋白 A、去唾液酸血清类黏蛋白及配体结合缺陷突变体对 LXRα 降解的影响。s，沉默 CHC 后检测 ASGR1 作用。t，Bafilomycin A1 处理。u，dorsomorphin 处理。v，A769662 处理。相关实验按所示条件重复两次，结果相似。
扩展数据图 4 | ASGR1 介导的糖蛋白摄取增加溶酶体氨基酸并激活 mTORC1
a，免疫纯化溶酶体评估。上图示意以 TMEM192-3×FLAG 作为诱饵蛋白快速分离溶酶体。b，在有无去唾液酸胎球蛋白 A 处理时，野生型或 ASGR1-KO Huh7 细胞溶酶体氨基酸倍数变化。c，溶酶体氨基酸转运蛋白 SLC38A9 是去唾液酸胎球蛋白 A 介导 mTORC1 激活所必需。d，救援实验。e，去唾液酸胎球蛋白 A 促进 mTOR 向溶酶体转位。f，用 Leica LAS X 软件定量共定位率。g，比较去唾液酸胎球蛋白 A 和白蛋白作为氨基酸来源刺激 S6K 磷酸化的能力。
扩展数据图 5 | 注射去唾液酸胎球蛋白 A 激活肝脏 mTORC1、抑制 AMPK 并增加脂质水平
8 周龄雄性 Asgr1 敲除小鼠和野生型雄性同窝小鼠随机分组，并给予高脂/高胆固醇/胆盐饮食 2 天，随后腹腔注射去唾液酸胎球蛋白 A 9 小时。a，肝样本免疫印迹。b，RT-qPCR 检测肝脏基因 mRNA。c，体重。d，肝体比。e，血糖。f，血清 ALT。g，血清 AST。h，血清 TC。i，血清 TG。j，肝脏 TC。k，肝脏 TG。l，胆汁胆固醇浓度。m，胆汁磷脂。n，胆汁胆固醇/磷脂比。o，胆汁胆汁酸浓度。p，胆囊胆汁体积。q，总胆汁酸。r，总胆汁胆固醇。s，胆汁代表图像。t，肝切片 H&E 和 Oil Red O 染色。
扩展数据图 6 | 雷帕霉素抑制 mTORC1、激活 AMPK、增加胆固醇排泄并降低脂质水平
10 周龄雄性 Asgr1 敲除小鼠和野生型雄性同窝小鼠随机分组，给予高脂/高胆固醇/胆盐饮食，并每日灌胃载体或 5 mg/kg/d 雷帕霉素，持续 2 周。a，肝样本免疫印迹。b，RT-qPCR 检测肝脏基因表达。c，体重。d，肝体比。e，血糖。f，食物摄入。g，血清 TC。h，血清 TG。i，肝脏 TC。j，肝脏 TG。k，血清 ALT。l，血清 AST。m，胆汁胆固醇浓度。n，胆汁磷脂。o，胆汁胆固醇/磷脂比。p，胆汁胆汁酸浓度。q，胆囊胆汁体积。r，总胆汁胆固醇。s，总胆汁酸。t，粪便胆固醇。u，胆汁代表图像。v，肝切片 H&E 和 Oil Red O 染色。
扩展数据图 7 | 肝脏 AMPK 敲低降低胆固醇排泄并增加脂质水平
8 周龄雄性 Asgr1 敲除小鼠和野生型雄性同窝小鼠随机分组，注射 AAV2/8-shAMPKα1、AAV2/8-shAMPKα2 或 AAV2/8-shControl。给予高脂/高胆固醇/胆盐饮食或普通饲料 4 周后进行分析。a，肝样本免疫印迹。b，RT-qPCR 测定肝脏基因表达。c，体重。d，肝体比。e，血糖。f，食物摄入。g，血清 TC。h，血清 TG。i，肝脏 TC。j，肝脏 TG。k，血清 ALT。l，血清 AST。m，胆汁胆固醇浓度。n，胆汁磷脂。o，胆汁胆固醇/磷脂比。p，胆汁胆汁酸浓度。q，胆囊胆汁体积。r，总胆汁胆固醇。s，总胆汁酸。t，粪便胆固醇。u，肝切片 H&E 和 Oil Red O 染色。
扩展数据图 8 | A769662 和 GW3965 联合给药复现 Asgr1−/− 小鼠表型
8 周龄雄性 Asgr1 敲除小鼠和野生型雄性同窝小鼠随机分组，给予高脂/高胆固醇/胆盐饮食。小鼠每日灌胃载体或 20 mg/kg/d GW3965，或每日两次腹腔注射 30 mg/kg A769662，持续 2 周。a，肝样本免疫印迹。b，RT-qPCR 测定肝脏基因表达。c，血清 TC。d，血清 TG。e，肝脏 TC。f，肝脏 TG。g，血清 AST。h，血清 ALT。i，胆汁胆固醇浓度。j，胆汁磷脂。k，胆汁胆固醇/胆汁磷脂比。l，胆汁胆汁酸浓度。m，胆囊胆汁体积。n，总胆汁胆固醇。o，总胆汁酸。p，粪便胆固醇。q，肝切片 H&E 和 Oil Red O 染色。
扩展数据图 9 | 沉默 Asgr1 增加胆固醇排泄并预防动脉粥样硬化
8 周龄 Balb/c 雄性小鼠注射 AAV2/8-shASGR1 或 AAV2/8-shControl，并给予高脂/高胆固醇/胆盐饮食 4 周。a，肝样本免疫印迹。b，RT-qPCR 测定肝脏基因表达。c，血清 TC。d，血清 TG。e，肝脏 TC。f，肝脏 TG。g，胆汁胆固醇浓度。h，胆汁胆汁酸浓度。i，胆囊胆汁体积。j，总胆汁胆固醇。k，总胆汁酸。l，体重。m，肝体比。n，血清 ALT。o，血清 AST。p-q，肝切片 H&E 和 Oil Red O 染色。r-z，9 周龄雄性 Ldlr−/− 小鼠注射 AAV2/8-shAsgr1 或对照病毒，年龄匹配野生型雄性 C57BL/6J 小鼠作为对照。小鼠给予普通饲料或高脂/高胆固醇/胆盐饮食 8 周。r，血 TC。s，血 TG。t，血清 ALT。u，血清 AST。v，体重。w，肝体比。x，主动脉树 Sudan IV 染色代表图像。y，对 x 中动脉粥样硬化病变定量。z，肝切片 H&E 或 Oil Red O 染色。
扩展数据图 10 | 抗 ASGR1 中和抗体制备
a，开发单克隆抗 ASGR1 中和抗体流程示意图。b，从 HEK293T 细胞纯化 ASGR1 蛋白的考马斯亮蓝染色代表图。c，分离 8 周龄雄性 C57B/L6 小鼠原代肝细胞，细胞用不同克隆抗 ASGR1 抗体孵育 72 小时。d，原代肝细胞用 4B9 IgG 孵育 72 小时，随后收获并进行 RNA 提取和 RT-qPCR 分析。e，Huh7 细胞转染指定质粒，48 小时后用 4B9-IgG、抗 Flag、抗 ASGR1 或抗 Actin 抗体进行免疫印迹。f-l，小鼠同图 4a。f，肝脏 mRNA 相对量。g，体重。h，食物摄入。i，肝体比。j，血糖。k，血清 ALT。l，血清 AST。
扩展数据图 11 | 接受抗 ASGR1（4B9-IgG）和阿托伐他汀处理小鼠的表征
小鼠同图 5a-l。a-b，RT-qPCR 分析肝脏基因表达。c，体重。d，食物摄入。e，肝体比。f，血糖。g，血清 ALT。h，血清 AST。i，胆汁胆固醇浓度。j，胆汁胆汁酸浓度。k-l，肝切片 H&E 或 Oil Red O 染色。
扩展数据图 12 | 接受抗 ASGR1（4B9-IgG）和依折麦布处理小鼠的表征
小鼠同图 5i-p。EZ：依折麦布。a-b，RT-qPCR 分析肝脏基因表达。c，体重。d，食物摄入。e，肝体比。f，血糖。g，血清 ALT。h，血清 AST。i，胆汁胆固醇浓度。j，胆汁胆汁酸浓度。k，肝切片 H&E 染色。
Nature Research Reporting Summary 译文
统计
对所有统计分析，作者需确认图注、表注、正文或 Methods 中包含以下信息：每个实验组或条件的精确样本量；测量是否来自不同样本或同一样本的重复测量；使用的统计检验及单双侧检验；所有协变量说明；正态性检验、多重比较校正等假设或校正说明；统计参数的完整描述，包括中心趋势和变异或不确定性估计；原假设检验中的检验统计量、置信区间、效应量、自由度和 P 值；贝叶斯分析中的先验和 MCMC 设置；层级或复杂设计中的测试层级与结果完整报告；效应量估计及计算方法。
软件和代码
数据采集使用的软件包括 ImageJ 1.50i、Bio-Rad CFX Connect Real-Time System、Microplate Manager 6 / SoftMax Pro 7.1、Tanon Imager 5200 v2.03、Leica SP8 共聚焦显微镜和 Leica LAS X v3.5.2.18963。统计计算使用 GraphPad Prism 9 和 Microsoft Excel 2020。Nature 鼓励将代码存入 GitHub 等社区仓库。
数据
所有免疫印迹源数据见补充图 1。图 1、2、4、5 和扩展数据图 1、2、4-12 的其他源数据包含在源数据文件中。支持本研究发现的二代测序数据已存入 NCBI GEO，登录号 GSE183013，可访问。其他所有数据可向通讯作者合理索取。
生命科学研究设计
样本量：未使用统计方法预先确定样本量。样本量根据统计要求以及本领域类似方法的既往研究确定。
数据排除：作者未从分析中排除样本或动物。
重复：所有动物实验和体外实验至少在两个独立实验中重复，所有重复尝试均成功。
随机化：所有样本/动物随机分组。
盲法：细胞和小鼠处理过程中研究者未设盲。所有数据分析由未设盲研究者完成。由于同一研究者需要执行相应操作，无法对研究者设盲。细胞或小鼠随机分配至不同组，并尽可能接受等同处理。未排除数据。所有分析均以可重复方式对相关样本进行。所有实验至少由两名研究者执行。
材料与实验系统
本研究涉及抗体、真核细胞系、动物和其他生物；不涉及古生物学、人类研究参与者或临床数据。
抗体：报告摘要列出了所有抗体的供应商、货号、批号和稀释比例，包括 anti-Flag、anti-Beta Actin、anti-phospho-ACC、anti-phospho-AMPKα、anti-p70 S6 Kinase、anti-phospho-ULK1、anti-phospho-Raptor、anti-phospho-4E-BP1、anti-LXRα、anti-LXRβ、anti-SREBP1、anti-BARD1、anti-BRCA1、anti-ABCG8、anti-ABCG5、anti-ABCA1、anti-CYP7A1、anti-FASN、anti-ASGR1、anti-GAPDH、anti-ubiquitin、anti-clathrin heavy chain、二抗等。商业抗体均由厂家充分验证，并在科学界广泛用于 western blot。本实验室制备的 anti-Myc、anti-HMGCR、anti-LDLR、anti-SREBP2、anti-EGFP 以及单克隆 anti-ASGR1 中和抗体，已在作者此前论文或扩展数据中验证。
真核细胞系：HEK293T 和 Huh7 细胞购自 ATCC。ASGR1-KO 细胞在本研究中使用 CRISPR-Cas9 系统生成。使用前未进行额外细胞系鉴定。细胞系经 PCR 检测为支原体阴性。未使用 ICLAC 登记的常见误认细胞系。
动物与其他生物：C57/B6J 小鼠购自 GemPharmatech 和湖北省疾控中心。图注和 Methods 中所述实验使用雌雄小鼠。Ldlr 敲除小鼠购自 GemPharmatech。Asgr1−/− 小鼠由 GemPharmatech 用 CRISPR-Cas9 系统生成。Asgr1+/− 杂交产生的同窝小鼠作为野生型对照。Lxrα 敲除小鼠由中国科学院上海营养与健康研究所尹慧勇馈赠。Asgr1−/−Lxrα−/− 双敲除小鼠由 Asgr1+/− 与 Lxrα+/− 小鼠杂交产生。所有小鼠在 SPF 环境中群养，温度 21-23 °C，相对湿度 50-60%，12 小时明暗周期（6:00-18:00 光照），处理前普通饲料饲养，年龄匹配小鼠按图注给予高脂/高胆固醇/胆盐饮食。本研究不涉及野生动物或野外采集样本。所有动物由武汉大学机构动物护理与使用委员会批准并按其指南维护和使用。
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致谢
作者感谢 J. Jing 和 D. Liang 的技术帮助，K. Liu 提供蛋白酶体抗体，G.-H. Shui（中国科学院遗传与发育生物学研究所）测量氧固醇，C.-T. Jiang（北京大学）测量胆汁酸，W. Qi（上海科技大学）参与有益讨论。本工作得到国家自然科学基金（编号 91957103、91954203 和 32021003）以及中国科技部项目（编号 2018YFA0800700）支持。宋保亮感谢腾讯基金会通过科学探索奖提供支持。
作者贡献
宋保亮构思项目并指导研究。王菊琼设计并实施总体实验、分析数据。胡奥进行溶酶体纯化实验。邓刚和赵晓露测量氨基酸。魏健进行生化检测和 Asgr1−/−Lxrα−/− 双敲除小鼠实验。李亮亮进行抗 ASGR1 抗体动物实验。李云峰、刘远斌和卢晓艺进行 AAV-shRNA 实验。李亮亮和邱志平协助小鼠品系表征、细胞实验和 western blot。宋保亮、王菊琼、施雄杰和罗杰在其他作者输入基础上撰写论文。
利益冲突
作者声明无竞争性利益。
附加信息
在线版本包含补充材料，地址为 https://doi.org/10.1038/s41586-022-05006-3。材料通信和请求应发送给宋保亮。Nature 感谢 Daniel Rader、Peter Tontonoz 和其他匿名审稿人对同行评审的贡献。重印和许可信息见 http://www.nature.com/reprints。