通过促进胆固醇排泄，抑制 ASGR1 可降低脂质水平
通过促进胆固醇排泄，抑制 ASGR1 可降低脂质水平
原文：Wang J.-Q. et al. Nature 608, 413-420 (2022)
DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05006-3
译文说明：本文根据 ~/Downloads/thesis_0520_xx.pdf 的可抽取文本翻译。正文、方法、主要图注和扩展数据图注已翻译；PDF 抽取出的图中坐标轴、P 值、泳道编号等碎片化内容未逐条重排。
作者
王菊琼、李亮亮、胡奥、邓刚、魏健、李云峰、刘远斌、卢晓艺、邱志平、施雄杰、赵晓露、罗杰、宋保亮
摘要
高胆固醇是心血管疾病的主要危险因素。目前还没有药物能够通过直接促进胆固醇排泄来降低胆固醇。人类遗传学研究发现，去唾液酸糖蛋白受体 1（asialoglycoprotein receptor 1, ASGR1）的功能缺失变异与较低胆固醇水平以及较低心血管疾病风险相关。
ASGR1 只在肝脏中表达，负责介导血液中去唾液酸糖蛋白的内吞和溶酶体降解。ASGR1 影响胆固醇代谢的机制此前尚不清楚。本文发现，Asgr1 缺失通过稳定 LXRα，降低血清和肝脏中的脂质水平。LXRα 上调 ABCA1 和 ABCG5/G8，分别促进胆固醇转运至高密度脂蛋白（HDL），以及排泄到胆汁和粪便中。
ASGR1 缺失会阻断糖蛋白的内吞和溶酶体降解，降低溶酶体内氨基酸水平，从而抑制 mTORC1 并激活 AMPK。一方面，AMPK 通过降低 LXRα 的泛素连接酶 BRCA1/BARD1 来增加 LXRα；另一方面，AMPK 抑制控制脂肪生成的 SREBP1。抗 ASGR1 中和抗体可通过增加胆固醇排泄来降低脂质水平，并与阿托伐他汀或依折麦布这两种常用降胆固醇药物产生协同有益作用。
总之，本研究表明，靶向 ASGR1 可上调 LXRα、ABCA1 和 ABCG5/G8，抑制 SREBP1 和脂肪生成，从而促进胆固醇排泄并降低脂质水平。
引言
胆固醇稳态依赖肠道胆固醇吸收、血浆脂蛋白摄取、从头合成、胆固醇分解代谢和排泄之间复杂的相互作用。迄今为止，主要有三类降胆固醇药物。第一类是他汀类药物，即 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A 还原酶（HMGCR）的竞争性抑制剂，它通过降低胆固醇生物合成、上调 LDL 受体（LDLR）并增强低密度脂蛋白（LDL）摄取来降低血浆胆固醇。第二类是依折麦布，它是肠道胆固醇吸收抑制剂，通过抑制 Niemann-Pick C1-like 1（NPC1L1）的内吞来阻断胆固醇摄入。第三类是 PCSK9 抑制剂，它通过稳定 LDLR 来增加肝脏对 LDL 的摄取。
虽然这些药物已被广泛使用，仍有相当一部分患者出现复发性心血管疾病，其 LDL 胆固醇水平也未能达到指南推荐目标。更重要的是，目前这些降胆固醇药物都不是通过直接促进胆固醇分解代谢或排泄来降低胆固醇。
胆固醇由 ABCG5 和 ABCG8 异二聚体排泄到胆汁和肠腔。ABCG5 或 ABCG8 突变会导致谷固醇血症，这是一种以甾醇累积和早发性动脉粥样硬化为特征的罕见疾病。在小鼠肝脏中过表达 ABCG5/G8 可增加肝胆胆固醇分泌并降低血浆胆固醇。ABCG5/G8 的表达主要在转录水平受 LXR 调控。药理性激活 LXR 可通过上调 ABCG5/G8 增加胆固醇外排。然而，LXR 也会增加 SREBP1（又称 ADD1），后者驱动脂肪酸生物合成基因表达，造成有害的肝脂肪变性和高甘油三酯血症。因此，直接 LXR 激动剂并不适合临床治疗高胆固醇血症。
一项针对冰岛人的大规模遗传学研究发现，ASGR1 功能缺失变异与较低胆固醇水平和较低心血管疾病风险相关。ASGR1 是去唾液酸糖蛋白受体的主要亚型，是一种肝脏特异性受体，介导多种脱唾液酸糖蛋白的内吞和溶酶体降解。ASGR1 优先识别其糖链末端的半乳糖或 N-乙酰半乳糖胺。缺失 Asgr1 的小鼠表型总体正常，Asgr1 缺失所带来的降胆固醇作用也在小鼠和猪中得到复现。然而，ASGR1 究竟如何调控胆固醇代谢，仍不清楚。
Asgr1 缺失增加胆固醇外排
为揭示 ASGR1 功能缺失变异影响胆固醇代谢的机制，研究者在人肝癌细胞系 Huh7 中敲低 ASGR1，并进行了 RNA 测序。基因集富集分析（GSEA）显示，LXR 靶基因显著富集。RT-qPCR 证实，包括 ABCG5、ABCG8 和 ABCA1 在内的经典 LXR 靶基因表达升高。有趣的是，在 ASGR1 敲低或敲除细胞中，LXRα 和 LXRβ 的蛋白水平升高；相反，过表达 ASGR1 则降低 LXRα、LXRβ 蛋白水平，以及 ABCG5、ABCG8 和 ABCA1 的 mRNA 水平。
ASGR1 在肝脏中高度表达。研究者构建了 Asgr1 缺失小鼠。杂合（Asgr1+/−）和纯合（Asgr1−/−）小鼠外观均基本正常。与野生型小鼠相比，Asgr1+/− 和 Asgr1−/− 小鼠血清总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平显著降低，并呈基因剂量依赖关系。肝脏 TC 和 TG 水平也低于野生型小鼠。与此一致，Asgr1 缺失显著减少肝脏脂滴累积，且未造成肝损伤。
值得注意的是，Asgr1 缺失小鼠胆囊中胆汁体积增加，胆汁胆固醇和胆汁酸浓度也升高。与野生型相比，Asgr1+/− 和 Asgr1−/− 小鼠总胆汁胆固醇分别增加 71% 和 114%，总胆汁酸也升高。Asgr1−/− 小鼠胆汁呈浑浊状，提示胆汁胆固醇增加。此外，Asgr1 缺失降低胆酸与鼠胆酸的比例，并使胆汁磷脂浓度略有升高。由于胆酸比鼠胆酸更能促进肠道胆固醇吸收，Asgr1 缺失小鼠胆汁酸组成的变化也可能有助于其较低胆固醇水平。
LXRα 是肝脏中占主导地位的 LXR 亚型，在 Asgr1−/− 肝脏中大幅升高。与此一致，Abcg5、ABCG8 和 CYP7A1 的表达增加，这解释了胆汁中胆固醇和胆汁酸水平升高，以及血清和肝脏脂质水平降低。尽管 LXRα 升高，Asgr1−/− 肝脏中 SREBP1 前体、核型 SREBP1 和脂肪酸合酶 FASN 的蛋白水平均明显下降。脂肪酸生物合成基因的 mRNA 水平也一致下调。进一步研究排除了 LDLR 和 HMGCR 蛋白水平、Dil-LDL 摄取或 PCSK9 促进 LDLR 降解的改变。Asgr1 缺失小鼠 LDL 清除未受损。TC 和 TG 分泌下降，可能是 Asgr1−/− 小鼠胆固醇排泄增加后的继发效应。Asgr1 缺失并未改变内源性 LXR 配体水平。雌性 Asgr1−/− 小鼠中也观察到类似的基因表达变化和代谢表型。
Asgr1−/− 的代谢获益依赖 LXRα
为确定 Asgr1−/− 小鼠的代谢改善是否源于 LXRα 升高，研究者获得了 Asgr1−/−Lxrα−/− 小鼠。Asgr1−/− 肝脏中 ABCG8、ABCA1 和 CYP7A1 蛋白水平的升高，在缺失 LXRα 后完全消失。由于 LXRα 驱动 Srebp1c 转录，Lxrα−/− 小鼠中 SREBP1c、FASN、LDLR 和脂肪酸生物合成基因均下调。Lxrα 缺失小鼠中 Abcg5、Abcg8、Abca1 和 Cyp7a1 的 mRNA 水平下降；在缺乏 LXRα 的情况下，Asgr1 缺失无法增加这些基因的表达。
虽然各组小鼠体重、食物摄入和血糖水平相似，敲除 Lxrα 导致肝脏脂滴大量累积、肝细胞气球样变，以及 ALT 和 AST 升高。Asgr1 缺失显著降低肝脏脂质含量和血清 TC、TG，但这些效果在 Lxrα 消融后完全消失。与野生型小鼠相比，Asgr1−/− 小鼠极低密度脂蛋白（VLDL）和 LDL 中的胆固醇含量明显下降，而 HDL 胆固醇水平升高。Lxrα 消融显著增加 VLDL 和 LDL 组分中的胆固醇，并抵消 Asgr1 缺失造成的脂质变化。
与野生型相比，Asgr1−/− 小鼠总胆汁胆固醇增加约两倍，但在 Asgr1−/−Lxrα−/− 小鼠中降至基础水平。粪便胆固醇也在 Asgr1−/− 小鼠中增加 48%，这一现象被 Lxrα 缺失削弱。这些结果与 Abcg5、Abcg8 和 Abca1 的表达变化一致：ABCG5/G8 将胆固醇排入胆汁，随后通过粪便排出体外；ABCA1 则将胆固醇转运至 HDL。
LXRα 降解需要 BRCA1 和 BARD1
研究者接着探究 ASGR1 调控 LXRα 的机制。MG132 可阻断 ASGR1 诱导的 LXRα 降解。过表达 ASGR1 增加 LXRα 泛素化，而敲除 ASGR1 降低其泛素化。由 BRCA1 和 BARD1 组成的 E3 泛素连接酶复合物可介导 LXRα 泛素化和降解。沉默 BRCA1 和 BARD1 显著削弱 ASGR1 促进的 LXRα 泛素化和降解。ASGR1 敲除或敲低降低 BRCA1 和 BARD1，并增加 LXRα。相反，ASGR1 以剂量依赖方式增加 BRCA1 和 BARD1。ASGR1 敲除或过表达并不改变其他 BRCA1/BARD1 底物，如 cyclin B1 和 Cdc25C。Ki-67 和 PCNA 染色显示 Asgr1 缺失肝脏中没有异常细胞增殖，蛋白酶体亚基也未改变。综上，Asgr1 缺失通过降低 BRCA1 和 BARD1 特异性增加 LXRα。
配体-ASGR1 通过 AMPK 调控 LXRα
ASGR1 是一种单跨膜蛋白，可结合血液中的多种去唾液酸糖蛋白。为检验配体-ASGR1 相互作用是否参与 LXRα 调控，研究者比较了有无胎牛血清（FBS）时 ASGR1 促进 LXRα 降解的情况。在无血清培养基中，ASGR1 不能诱导 LXRα 降解。去唾液酸胎球蛋白 A 或去唾液酸血清类黏蛋白是 ASGR1 的高亲和力天然配体，在无血清培养基且存在 ASGR1 时，可剂量依赖性刺激 LXRα 降解。同时，去唾液酸胎球蛋白 A 与 ASGR1 协同增强 LXRα 泛素化。配体结合缺陷突变体 ASGR1(6A) 不能促进 LXRα 降解。去唾液酸胎球蛋白 A 处理增加内源性 BRCA1 和 BARD1，并降低 LXRα。沉默 ASGR1 或 BRCA1/BARD1 使 LXRα 维持在较高水平，并消除去唾液酸胎球蛋白 A 诱导的 LXRα 降解。这些结果说明，去唾液酸糖蛋白结合 ASGR1 后增加 BRCA1/BARD1，从而促进 LXRα 降解。
血液中的去唾液酸糖蛋白通过肝脏 ASGR1 经网格蛋白介导的内吞进入细胞。内体中的酸性环境诱导 ASGR1 与糖蛋白解离，ASGR1 回收到质膜，而去唾液酸糖蛋白被递送至溶酶体降解。研究者进一步分析去唾液酸糖蛋白的内吞和溶酶体降解是否是 ASGR1 调控 LXRα 所必需。沉默网格蛋白重链（CHC）消除 ASGR1 或去唾液酸胎球蛋白 A 诱导的 LXRα 降解。无论是否接受去唾液酸胎球蛋白 A 处理，CHC 沉默细胞中的 BRCA1 和 BARD1 水平均低于对照细胞。
溶酶体降解释放的糖和氨基酸等营养物质可以激活 mTORC1 并抑制 AMPK。mTORC1 激活 SREBP 和 USP20，促进脂质生物合成；相反，AMPK 抑制 SREBP 并下调 BRCA1。与这些发现一致，去唾液酸胎球蛋白 A 处理在对照细胞中激活 mTORC1 并抑制 AMPK，同时增加 BRCA1 和 BARD1、降低 LXRα。这些作用在 CHC 沉默细胞中消失。Bafilomycin A1（BFA）通过升高溶酶体 pH 破坏溶酶体降解，从而抑制 mTORC1 并激活 AMPK。在 BFA 处理的野生型细胞中，BRCA1 和 BARD1 下降，LXRα 上升。BFA 也阻断 ASGR1 诱导的 LXRα 降解。ASGR1 缺失抑制 mTORC1、激活 AMPK，进一步导致 BRCA1 和 BARD1 降低以及 LXRα 升高；而 BFA 处理阻断 ASGR1 缺失对 mTORC1、AMPK、BRCA1/BARD1 或 LXR 的影响。
随后研究者检测 ASGR1 的作用是否依赖 AMPK。AMPK 激动剂 A769662 增加 LXRα 和 p-ACC，并降低 n-SREBP1、n-SREBP2、BRCA1 和 BARD1。AMPK 抑制剂 dorsomorphin 则产生相反效果。A769662 减弱 ASGR1 诱导的 LXRα 降解；相反，dorsomorphin 阻断 ASGR1 缺失诱导的 LXRα 增加。
为明确去唾液酸糖蛋白消化产生哪些营养物质调控 mTORC1，研究者快速分离溶酶体并直接测量氨基酸水平。去唾液酸胎球蛋白 A 处理增加野生型细胞溶酶体中大多数氨基酸水平，但在 ASGR1-KO 细胞中无此作用。转运蛋白 SLC38A9 对亮氨酸和其他氨基酸激活 mTORC1 是必需的。确实，去唾液酸胎球蛋白 A 以 SLC38A9 依赖方式增加 p-S6K。野生型 SLC38A9 可在 SLC38A9 敲除细胞中恢复 S6K 磷酸化，而影响 SLC38A9-Ragulator 相互作用或 SLC38A9 转运活性的突变则不能恢复。去唾液酸胎球蛋白 A 可使 mTOR 重新定位至溶酶体。白蛋白激活 mTORC1 的能力弱于去唾液酸胎球蛋白 A，提示 ASGR1 介导的糖蛋白摄取非常高效。
这些结果支持一个工作模型：ASGR1 结合去唾液酸糖蛋白，并通过网格蛋白介导的内吞将其递送至溶酶体。糖蛋白被消化后释放氨基酸，激活溶酶体 mTORC1 并抑制 AMPK。这同时导致 SREBP 激活、脂肪生成增加，以及 BRCA1 和 BARD1 表达增加，后者促进 LXRα 降解并降低胆固醇外排。通过这一过程，摄入的营养物质支持细胞生长。当 ASGR1 突变或被抑制时，去唾液酸糖蛋白的内吞和溶酶体降解被阻断，导致 mTORC1 抑制和 AMPK 激活。AMPK 使 BRCA1/BARD1 不稳定，从而增加 LXRα，并上调包括 ABCA1 和 ABCG5/G8 在内的胆固醇转运蛋白。ABCA1 将胆固醇递送至 HDL，促进逆向胆固醇转运；ABCG5/G8 将胆固醇泵入胆汁，使胆固醇通过粪便排出。同时，激活的 AMPK 通过抑制 SREBP 抑制脂肪生成。由此，ASGR1 缺失可增加胆固醇外排，而不像泛 LXR 激动剂那样诱导脂肪生成。
Asgr1−/− 通过 AMPK 产生代谢获益
接下来，研究者设计了一系列动物实验进行体内验证。首先，向野生型小鼠静脉注射一次性大剂量去唾液酸胎球蛋白 A，导致肝脏中 p-S6K 和 p-4E-BP1 升高，提示 mTORC1 激活；同时 p-AMPK、p-Raptor、p-ACC 和 p-ULK1 降低，提示 AMPK 被抑制。BARD1 增加，LXRα 降低。相应地，Abcg5、Abcg8、Abca1 和 Cyp7a1 表达下降；Srebp1c、Fasn 和 Scd1 mRNA 上调；肝脏和血清 TC、TG 明显增加，胆固醇和胆汁酸向胆汁的排泄大幅减少。相反，Asgr1−/− 小鼠表现为 mTORC1 受抑、AMPK 激活、LXRα 增加、脂肪酸生物合成基因表达下降和代谢谱改善，且这些表型不受去唾液酸胎球蛋白 A 注射影响。
其次，研究者用 mTOR 抑制剂雷帕霉素模拟 Asgr1 缺失诱导的 mTORC1 抑制。雷帕霉素显著增加 p-AMPK、p-Raptor、p-ULK1 和 p-ACC，证实抑制 mTORC1 可激活 AMPK。同时，LXRα、ABCG5、ABCG8、ABCA1 和 CYP7A1 水平升高，而 FASN 水平下降，这与 AMPK 抑制 SREBP 通路一致。雷帕霉素降低血清和肝脏中的 TC、TG，并增加胆汁胆固醇、胆汁酸和粪便胆固醇。
第三，研究者通过靶向 AMPK 催化亚基亚型 Prkaa1 和 Prkaa2 的 AAV-shRNA，考察 AMPK 对 Asgr1 缺失诱导的代谢改善是否必需。AMPK 耗竭一致激活 mTORC1，并在很大程度上逆转 Asgr1 缺失肝脏中 LXRα、ABCA1、ABCG5、ABCG8 和 CYP7A1 的升高。肝脏 AMPK 耗竭增加血清和肝脏 TC、TG 水平。值得注意的是，AMPK shRNA 在野生型和 Asgr1−/− 小鼠中均降低胆汁胆固醇、胆汁酸以及粪便胆固醇。
最后，研究者使用 LXR 激动剂 GW3965 和 AMPK 激动剂 A769662，检验 AMPK 激活是否可抑制脂质生物合成，并区分 ASGR1 缺失与直接 LXR 激活。A769662 确实激活 AMPK 并随后抑制 mTORC1；它还降低 BARD1 并增加 LXRα，说明 AMPK 激活确实会升高 LXRα。此外，A769662 增加 ABCG8、ABCA1 和 CYP7A1。单独或联合给予 GW3965 和 A769662 均降低血清和肝脏胆固醇水平，并增加胆固醇向胆汁和粪便的排泄，因为二者均可激活 LXR。由于 AMPK 抑制 SREBP，A769662 显著降低 Srebp2、Hmgcr、Srebp1c、Fasn 和 Scd1 mRNA。值得注意的是，GW3965 增加 LXR 靶基因表达，而联合 A769662 可降低 Srebp1c、Fasn 和 Scd1 mRNA，但不降低 Abcg5、Abcg8、Abca1 和 Cyp7a1 等其他 LXR 靶基因。GW3965 增加肝脏 TG，这是泛 LXR 激动剂的主要副作用；然而，与 A769662 联合给药后，肝脏 TG 较 GW3965 组下降 47.5%。总之，GW3965 与 A769662 联合给药可复现 Asgr1 缺失的基因表达和代谢表型。
抑制 ASGR1 的治疗潜力
RNA 干扰（RNAi）正成为一种有力的治疗方法。研究者使用 AAV-shRNA 在肝脏中沉默 Asgr1。LXRα、ABCG8、ABCA1 和 CYP7A1 蛋白水平显著升高，而 Srebp1c、Fasn 和 Scd1 mRNA 降低。Asgr1 敲低后，血清和肝脏中 TC、TG 水平显著下降。值得注意的是，注射 AAV-shAsgr1 的小鼠总胆汁胆固醇增加超过 1.4 倍，总胆汁酸也同步增加。AAV-shAsgr1 未改变体重，也未造成肝损伤。在 Ldlr−/− 小鼠中，敲低 Asgr1 显著预防高脂/高胆固醇/胆盐饮食诱导的动脉粥样硬化斑块形成和肝脏脂质沉积。
为进一步理解 ASGR1 抑制的治疗效果，研究者开发了抗 ASGR1 单克隆中和抗体。4B9-IgG 克隆以剂量依赖方式增加 LXRα，并上调 Abcg5 和 Abcg8 表达。4B9-IgG 识别 ASGR1 中位于糖识别结构域的区域（氨基酸 182-274）。
野生型和 Asgr1−/− 小鼠接受对照 IgG 或 4B9-IgG 腹腔注射。4B9-IgG 处理的野生型小鼠中 LXRα 显著增加，LXRβ 略有增加，ABCG8、CYP7A1 和 ABCA1 表达明显升高。4B9-IgG 激活 AMPK，并降低 SREBP1、FASN 和 BARD1。与此一致，4B9-IgG 在野生型小鼠肝脏中上调 Abcg5、Abcg8、Abca1 和 Cyp7a1 转录，并降低 Srebp1c、Fasn 和 Scd1 mRNA。在 Asgr1−/− 小鼠中，4B9-IgG 不改变 AMPK 激活或上述基因表达。
在野生型小鼠中，4B9-IgG 分别使血清 TC 和 TG 降低 50% 和 22%，肝脏 TC 和 TG 也显著下降。4B9-IgG 处理还使胆囊胆汁体积增加 62%，胆汁胆固醇浓度增加 67%，导致野生型小鼠总胆汁胆固醇增加超过一倍。对照 IgG 处理的野生型小鼠胆汁清澈，而 4B9-IgG 注射小鼠或 Asgr1−/− 小鼠胆汁不透明。4B9-IgG 处理的野生型小鼠粪便胆固醇增加约 87%。胆汁胆汁酸浓度和总胆汁酸也因 4B9-IgG 而增加。值得注意的是，4B9-IgG 不改善 Asgr1−/− 小鼠代谢谱，支持 4B9-IgG 的特异性。未检测到其他代谢改变或肝损伤。
抗 ASGR1 与他汀/依折麦布协同
研究者随后考察 4B9-IgG 是否与现有药物阿托伐他汀和依折麦布产生协同降脂作用。不论是否使用阿托伐他汀，4B9-IgG 都在野生型小鼠中激活 AMPK、增加 LXRα、上调 Abcg5、Abcg8、Abca1 和 Cyp7a1 表达，并降低 Srebp1c、Fasn 和 Scd1 表达。单独使用 4B9-IgG 或阿托伐他汀均可相似地降低野生型小鼠 TC 和 TG。体重和其他代谢参数相似。值得注意的是，4B9-IgG 与阿托伐他汀联合给药显著降低野生型小鼠血清和肝脏脂质水平。Asgr1−/− 小鼠 TC 和 TG 水平远低于野生型小鼠。阿托伐他汀可进一步降低血清脂质水平，而 4B9-IgG 在 Asgr1−/− 小鼠中无效。与图 4 结果一致，无论是否使用阿托伐他汀，4B9-IgG 均显著增加野生型小鼠总胆汁胆固醇、总胆汁酸和粪便胆固醇。单独阿托伐他汀对胆汁胆固醇、胆汁酸或粪便胆固醇水平无影响。
最后，研究者用 4B9-IgG 和依折麦布处理小鼠。在野生型小鼠中，无论是否存在依折麦布，4B9-IgG 均以阻断 ASGR1 的方式发挥作用。4B9-IgG 与依折麦布协同降低野生型小鼠血清和肝脏中的 TC、TG，尽管单独处理也能改善脂质谱。在 Asgr1−/− 小鼠中，依折麦布仍可降低血清和肝脏中的脂质含量，而 4B9-IgG 无效。依折麦布显著降低野生型小鼠总胆汁胆固醇，因为它抑制膳食胆固醇吸收。即使合用依折麦布，4B9-IgG 仍可增加野生型小鼠总胆汁胆固醇和胆汁酸。
讨论
mTORC1 和 AMPK 是两个感知细胞营养状态并控制代谢的主调控因子。它们通过多种机制反向调控。虽然 AMPK 被认为可能成为代谢疾病治疗靶点，但泛 AMPK 激动剂会导致心脏肥大，限制其临床应用。除 AMPK 激活的组织特异性作用外，细胞内 AMPK 还存在区室化，并受药物、营养可用性和 AMP 的差异调控，从而导致不同靶标被磷酸化。因此，在药物开发中，选择性 AMPK 激活对获得代谢获益并避免不良反应至关重要。
本文揭示 mTORC1 和 AMPK 可受 ASGR1 调节。去唾液酸糖蛋白经 ASGR1 介导的内吞进入肝细胞，其溶酶体消化释放的氨基酸激活 mTORC1。从概念上看，这一发现与此前关于自噬或巨胞饮产生的溶酶体氨基酸可激活 mTORC1 的认识一致。抑制 ASGR1 可阻断受体介导的去唾液酸糖蛋白内化及随后的溶酶体消化，从而激活 AMPK 并抑制 mTORC1。这一机制提供了一种高度局部化的信号，可实现选择性 AMPK 激活。
胆固醇外排通过 LXRα 和 ABCG5/G8 增加。由于 ABCA1 被 LXRα 上调，脂蛋白谱也得到改善，表现为 HDL 胆固醇升高、LDL 胆固醇降低。作为 mTORC1 抑制和 AMPK 激活的结果，SREBP1 被抑制，从而防止脂肪生成。此外，Ttc39b 消融可增加 LXRα 和 ABCG5/G8 而不激活 SREBP1，这也证实 ABCG5/G8 表达可与 SREBP1 表达脱耦。由于 ASGR1 几乎只在肝细胞中表达，靶向 ASGR1 为肝脏特异性激活 AMPK 和抑制 mTORC1 开辟了路径，可绕开泛 AMPK 激动剂的不良副作用。
在治疗高血糖的药物中，钠-葡萄糖协同转运蛋白 2（SGLT2）抑制剂通过阻断肾脏葡萄糖重吸收，促进葡萄糖经尿液排泄。这些抑制剂产生多重有益作用，主要是因为它们促使肾脏将葡萄糖移出体外。胆固醇是一种带有四环结构的脂质，难以分解，并且是强促炎分子，可加速动脉粥样硬化和非酒精性脂肪性肝炎。抑制 ASGR1 可增加胆固醇向胆汁和随后向粪便的排泄，为降低胆固醇提供了一种独特方式。事实上，ASGR1 功能缺失变异已被发现与较低非 HDL 胆固醇和较低心血管疾病风险相关，这提示 ASGR1 抑制是一种安全有效的心血管疾病治疗方式。
在线内容
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方法
小鼠
Asgr1 敲除小鼠由 CRISPR-Cas9 系统生成。单导 RNA（sgRNA）和供体共同注射入 C57BL/6J 合子。sgRNA 引导 Cas9 核酸内切酶在内含子 2-3 和内含子 8-9 中切割，如扩展数据图 1 所示。LXRα 敲除小鼠由中国科学院上海营养与健康研究所尹慧勇馈赠。
C57/B6J 小鼠（6-8 周龄）购自 GemPharmatech 和湖北省疾控中心。图注所述实验使用了雌雄小鼠。C57/B6J Ldlr−/− 小鼠购自 GemPharmatech。Asgr1+/− 杂交产生的野生型同窝小鼠作为动物实验对照。为生成 Asgr1−/−Lxrα−/− 双敲除小鼠，将 Asgr1+/− 与 Lxrα+/− 小鼠杂交。所有小鼠饲养于 SPF 环境，温度 22 ± 1 °C，相对湿度 50-60%，光照周期为 06:00-18:00。处理前所有动物均维持普通饲料。按图注所述，年龄匹配小鼠给予高脂/高胆固醇/胆盐饮食。处死前所有小鼠禁食 4 小时。由于研究者必须执行相应操作，无法对实验者实施盲法。小鼠随机分配至不同组，并尽可能接受等同处理。没有数据被排除。所有动物操作均经武汉大学动物护理与使用委员会批准。
材料和质粒
MG132 购自 Boston Biochem；dorsomorphin 2HCl（AMPK 抑制剂）和 A769662（AMPK 激活剂）购自 Target Molecule；bafilomycin A1 购自 MCE；洛伐他汀购自上海 Pharm Valley；甲羟戊酸和胎球蛋白 A 购自 Sigma；EZ18D03841 购自 Steroloids；阿托伐他汀购自 Energy Chemical；Dil-LDL 购自 Yeasen；血清类黏蛋白购自 Abcam；PMSF 购自 Thermo Scientific；雷帕霉素和 GW3965 购自 Topscience；poloxamer 407 购自 Sigma；放射性胆固醇油酸酯购自 Perkin Elmer；DOPC 和 DAB 底物试剂盒分别购自 Sigma 和 Abcam。脂蛋白缺乏血清（LPDS）由新生牛血清在本实验室经超速离心制备。
研究者使用标准分子克隆方法构建了多种质粒，包括编码全长小鼠 Asgr1 的 pCMV-ASGR1-3×FLAG，带 EGFP 或 5×MYC 标签的小鼠 LXRα 表达质粒，带 HA 标签的人 Ubi 质粒，带 5×MYC 标签的人 BARD1 和小鼠 LDLR 质粒等。ASGR1 截短质粒和 ASGR1(6A) 突变体均通过 QuikChange 构建。pCMV-EGFP-BRCA1 来自 Addgene。TMEM192 编码区从 Huh7 细胞 cDNA 扩增并连接至 pCMV14-3×FLAG，再亚克隆至 pLVX-IRES-puro。野生型和突变型 SLC38A9 cDNA 由同济大学王鹏提供并亚克隆至 pLVX-IRES-puro。
细胞培养与细胞系构建
Huh7 和 HEK293T 细胞在 37 °C、5% CO2 条件下培养，培养基为含青霉素、链霉素和 10% FBS 的 DMEM。原代小鼠肝细胞从普通饲料喂养的 8 周龄雄性 C57BL/6J 小鼠新鲜分离，并在含 5% FBS、青霉素和链霉素的 Medium 199 中培养。胆固醇耗竭培养基为含 5% LPDS、1 μM 洛伐他汀和 10 μM 甲羟戊酸钠的 DMEM。
ASGR1 KO 细胞使用 CRISPR-Cas9 基因组编辑系统构建。人 ASGR1 靶向 sgRNA 克隆入 pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 载体后，与 pLKO.1 共转染 Huh7 细胞。转染后用含 10% FBS 和嘌呤霉素的 DMEM 筛选，直至形成单克隆。稳定表达 ASGR1 的 Huh7 细胞通过 pCMV-ASGR1-3×FLAG 瞬时转染后 G418 筛选生成。SLC38A9 敲除细胞通过预验证 guide RNA 和 pX330 系统构建，并以免疫印迹确认。
泛素化检测
Huh7 细胞接种于 6 cm 培养皿，按图注进行质粒转染和处理。48 小时后，细胞用预冷 PBS 清洗，并以免疫沉淀缓冲液裂解。裂解液离心后，上清与抗 FLAG M2 琼脂糖珠在 4 °C 孵育 4 小时。内源性 LXR 泛素化检测中，裂解液先用抗 LXR 抗体和 protein A/G 琼脂糖珠免疫沉淀。珠子经含蛋白酶抑制剂的免疫沉淀缓冲液洗涤后，在不含 β-巯基乙醇的上样缓冲液中煮沸，随后进行 western blot 分析。
Dil-LDL 内吞
siRNA 介导的 ASGR1 敲低细胞和对照细胞接种于玻片上。收获前，细胞在 4 °C 下用胆固醇耗竭培养基孵育 30 分钟，再转入含 10 μg/ml Dil-LDL 的新鲜胆固醇耗竭培养基中 4 °C 孵育 1 小时。PBS 清洗两次后转至 37 °C，在指定时间点收获。最后用 4% 多聚甲醛固定，并在 Leica SP8 共聚焦显微镜下成像。内吞 Dil-LDL 的荧光强度用 ImageJ 定量。
RNA-seq 和 GSEA
Huh7 细胞转染乱序 siRNA 或 ASGR1 靶向 siRNA，每组 3 个生物学独立重复。72 小时后收获细胞提取 RNA，并进行 RNA-seq。随后使用 GSEA 软件按说明分析。研究者自定义 GO pathway 的 C5 子集，并从已发表数据中选取 LXR 靶基因作为新子集，最终得到富集分数、NOM、P 值等数据，并用 Prism v9.0 导出折线图。
AAV2/8 介导的基因表达和敲低
AAV 克隆载体来自 Obio Technology 和 PackGene Biotech。AAV2/8-shControl、AAV2/8-shAsgr1、AAV2/8-shAMPKα1 和 AAV2/8-shAMPKα2 通过将相应 shRNA 克隆入载体制备。小鼠通过尾静脉使用 29G 胰岛素注射器注射 AAV8。
去唾液酸糖蛋白制备
胎球蛋白 A 和血清类黏蛋白按既往方法脱唾液酸。简言之，将糖蛋白置于 0.1 mol/l HCl 三氟乙酸中，80 °C 处理 2 小时。
溶酶体快速纯化和代谢组学分析
表达 TMEM192-3×FLAG 或对照的慢病毒颗粒在 HEK293T 细胞中产生。病毒上清用于转导 Huh7 细胞，并以嘌呤霉素筛选。对照或 TMEM192-3×FLAG 过表达 Huh7 细胞接种于培养皿，生长至接近汇合后，以 EBSS 洗涤并在含葡萄糖的 EBSS 中孵育，随后加入去唾液酸胎球蛋白 A。细胞用冰冷 KPBS 洗涤、刮取、Dounce 匀浆，裂解液与抗 FLAG 磁珠短时间孵育。珠子清洗后用 SDS（用于免疫印迹）或 80% 甲醇（用于氨基酸定量）洗脱。
溶酶体代谢物提取时，将结合溶酶体的珠子重悬于冰冷代谢物提取缓冲液，涡旋、液氮冻融三次，超声并离心。部分上清用于 Amplex Red 法胆固醇定量，其余经 speedvac 完全干燥，重新溶解于 50% 乙腈中，并在 Waters Acquity UPLC 与 SCIEX 5500 QTRAP 系统上进行超高效液相色谱-串联质谱分析。使用 BEH Amide 色谱柱，正离子电喷雾模式，多反应监测检测，峰识别和面积积分用 Analyst 和 SCIEX OS 软件完成。胆固醇定量用于归一化。
VLDL 分泌、脂蛋白清除和组织学分析
10 周龄雄性野生型和 Asgr1−/− 小鼠给予高脂/高胆固醇/胆盐饮食 2 天，禁食 4 小时后腹腔注射 poloxamer 407。按指定时间点采血，并用试剂盒测量 TC 和 TG。
人 LDL 从健康供者血浆中通过连续超速离心分离。放射性标记胆固醇油酸酯脂质体按既往方法制备并掺入 LDL。10 周龄小鼠喂食高脂/高胆固醇/胆盐饮食 2 天后，禁食 17 小时并复喂 6 小时，静脉注射放射性标记 LDL，在 0 和 30 秒以及 20-120 分钟多个时间点采样，用闪烁计数仪测定血浆放射性。
免疫组织化学中，石蜡切片经脱蜡、梯度乙醇处理、抗原修复、过氧化物酶灭活、封闭、一抗孵育、二抗孵育和 DAB 显色后，用苏木精复染并显微观察。动脉粥样硬化病变分析中，分离小鼠主动脉树，用 4% 多聚甲醛固定，去除血管周围脂肪组织后用 Sudan IV 染色并成像。
siRNA 敲低、免疫印迹和 RT-qPCR
基因特异性 siRNA 由广州锐博生物设计合成，并用 Lipofectamine RNAiMAX 转染。文中列出了 ASGR1、ASGR2、BARD1、BRCA1、CHC 和对照 siRNA 序列。
细胞或肝组织用含蛋白酶抑制剂的 RIPA 缓冲液裂解，蛋白浓度用 BCA 试剂盒测定。样品与上样缓冲液混合后，经 SDS-PAGE 分离、转移至 PVDF 膜并进行 western blot。研究使用了抗 FLAG、β-actin、p-ACC、p-AMPKα、S6K、p-ULK1、p-Raptor、p-4E-BP1、ULK1、Raptor、ACC、AMPKα1/2、Cyclin B1、CDC25C、蛋白酶体亚基、Ki-67、PCNA、LXRα、LXRβ、SREBP1/2、BARD1、BRCA1、ABCG8、ABCG5、ABCA1、CYP7A1、FASN、ASGR1、GAPDH、泛素、CHC、Myc、HMGCR、LDLR、EGFP 等抗体。
RT-qPCR 中，使用 Trizol 从肝组织或细胞中提取总 RNA，并用 DNase I 去除基因组 DNA。使用 M-MLV 逆转录酶进行逆转录，在 Bio-Rad CFX384 或 CFX96 上使用 SYBR Green Master Mix 进行定量 PCR。RNA 表达水平按 ΔΔCt 方法计算，引物序列见补充表 2。
生化检测和统计分析
血糖用尾静脉血和血糖仪测定。全血样本从小鼠眶后静脉丛采集，室温凝血后离心分离血清。血清 TC 和 TG 用商业试剂盒测定。肝脏脂质用甲醇-氯仿提取，肝脏 TC 和 TG 用商业试剂盒测定。ALT 和 AST 用南京建成试剂盒测定。禁食 4 小时后收集胆囊胆汁，胆汁体积用移液器估算。胆汁样本经水稀释和氯仿/甲醇萃取后，分别测定胆固醇、胆汁酸和磷脂。粪便样本从单笼饲养小鼠收集 3 天，冻干称重后提取胆汁酸和脂质。
未使用统计方法预先确定样本量。样本量根据既往研究和统计要求确定。n 值代表体内实验中的单只小鼠。所有动物实验和体外检测至少在两个独立实验中重复，重复均成功。数据表示为均值 ± s.e.m.。统计分析使用 GraphPad Prism v9 或 Microsoft Excel 2020，根据图注采用单因素 ANOVA 后 Tukey 检验、非配对双尾 Student t 检验，或双因素 ANOVA 后 Šídák 多重比较检验。P < 0.05 认为具有统计学意义。
报告摘要和数据可用性
更多研究设计信息可见本文链接的 Nature Research Reporting Summary。所有免疫印迹源数据见补充图 1；图 1、2、4、5 和扩展数据图 1、2、4-12 的其他源数据随本文提供。支持本研究发现的二代测序数据已存入 NCBI GEO，登录号为 GSE183013。
致谢、作者贡献和其他信息
作者感谢 J. Jing 和 D. Liang 的技术帮助，K. Liu 提供蛋白酶体抗体，G.-H. Shui 测量氧固醇，C.-T. Jiang 测量胆汁酸，W. Qi 参与有益讨论。本工作得到国家自然科学基金和中国科技部项目支持。宋保亮感谢腾讯基金会科学探索奖支持。
宋保亮构思项目并指导研究。王菊琼设计并实施总体实验、分析数据。胡奥进行溶酶体纯化实验。邓刚和赵晓露测量氨基酸。魏健进行生化检测和 Asgr1−/−Lxrα−/− 双敲除小鼠实验。李亮亮进行抗 ASGR1 抗体动物实验。李云峰、刘远斌和卢晓艺进行 AAV-shRNA 实验。李亮亮和邱志平协助小鼠品系表征、细胞实验和 western blot。宋保亮、王菊琼、施雄杰和罗杰在其他作者输入基础上撰写论文。
作者声明无竞争性利益。补充信息可在论文在线版本中获得。材料通信和请求应发送给宋保亮。Nature 感谢 Daniel Rader、Peter Tontonoz 和其他匿名审稿人对同行评审的贡献。重印和许可信息见 Nature 网站。
主要图注译文
图 1 | Asgr1 缺失增加 LXRα 和胆固醇排泄，并降低脂质水平
a，GSEA 显示 LXR 靶基因富集。Huh7 细胞转染乱序 siRNA 或 ASGR1 靶向 siRNA 后提取 RNA，进行深度测序和 GSEA。b，RT-qPCR 分析 mRNA 相对量。c，免疫印迹分析，处理同 b。d，野生型及两个 ASGR1 敲除 Huh7 细胞的免疫印迹。e，野生型 Huh7 细胞和稳定表达 ASGR1 的 Huh7 细胞的免疫印迹。f，RT-qPCR 分析。g-s，8 周龄雄性 Asgr1+/−、Asgr1−/− 及野生型同窝小鼠随机分组，给予高脂/高胆固醇/胆盐饮食 4 周。检测血清 TC、血清 TG、肝脏 TC、肝脏 TG、肝脏 H&E 和 Oil Red O 染色、胆囊胆汁体积、胆汁胆固醇浓度、胆汁酸浓度、总胆汁胆固醇、总胆汁酸、胆汁代表图像、肝脏免疫印迹和肝脏基因表达。所有数值为均值 ± s.e.m.。
图 2 | Asgr1−/− 小鼠的代谢改善依赖 LXRα
所有动物由 Asgr1+/−Lxrα+/− 小鼠杂交产生。8 周龄雄性小鼠随机分组并给予高脂/高胆固醇/胆盐饮食 6 周。a，肝脏样本免疫印迹。b-e，血清 TC、血清 TG、肝脏 TC 和肝脏 TG。f,g，脂蛋白谱分析。h，总胆汁胆固醇。i，粪便胆固醇。所有数值为均值 ± s.e.m.。
图 3 | 去唾液酸糖蛋白-ASGR1-AMPK/mTORC1 轴调控 LXRα 和 SREBP
a，Huh7 细胞转染对照 siRNA 或靶向 BRCA1/BARD1 的 siRNA，以及 LXRα、泛素和 ASGR1 表达质粒，收获前用 MG132 处理。b，Huh7 细胞转染 LXRα、泛素和 ASGR1 表达质粒，在无血清培养基中用去唾液酸胎球蛋白 A 处理，再用 MG132 处理。c，Huh7 细胞转染 siRNA 并在无血清培养基中用去唾液酸胎球蛋白 A 处理。d，Huh7 细胞转染乱序 siRNA 或 CHC siRNA 后处理。e，Huh7 和 ASGR1 KO 细胞用 bafilomycin A1 处理。f，Huh7 细胞用 A769662 处理。g，Huh7 和 ASGR1 KO 细胞先在无糖培养基中预处理，再用 dorsomorphin 处理。h，ASGR1 调控机制模型。
图 4 | 抗 ASGR1 中和抗体促进胆固醇排泄
8 周龄雄性 Asgr1−/− 小鼠和野生型同窝小鼠随机分组，给予高脂/高胆固醇/胆盐饮食。每隔一天腹腔注射对照 IgG 或抗 ASGR1 中和抗体 4B9-IgG，持续 14 天。检测肝脏免疫印迹、血清 TC、血清 TG、肝脏 TC、肝脏 TG、胆囊胆汁体积、胆汁胆固醇浓度、总胆汁胆固醇、胆汁代表图像、粪便胆固醇、胆汁酸浓度和总胆汁酸。
图 5 | 抗 ASGR1 与阿托伐他汀和依折麦布具有协同降脂作用
a-h，8 周龄雄性 Asgr1−/− 小鼠和野生型同窝小鼠随机分组并给予高脂/高胆固醇/胆盐饮食。小鼠每日灌胃载体或阿托伐他汀，并每隔一天腹腔注射对照 IgG 或 4B9-IgG，持续 14 天。检测肝脏免疫印迹、血清 TC、血清 TG、肝脏 TC、肝脏 TG、总胆汁胆固醇、总胆汁酸和粪便胆固醇。i-p，类似实验中小鼠每日灌胃载体或依折麦布，并注射对照 IgG 或 4B9-IgG，持续 8 天。检测肝脏免疫印迹、血清和肝脏脂质、总胆汁胆固醇、总胆汁酸以及肝脏 Oil Red O 染色。
扩展数据图注译文
扩展数据图 1 | Asgr1−/− 小鼠表征及 ASGR1 对脂质代谢影响分析
a，鼠 ASGR1 蛋白组织分布。b，Asgr1 敲除小鼠构建示意图。c，Asgr1+/+、Asgr1+/− 和 Asgr1−/− 小鼠 DNA 分型。d，肝裂解液免疫印迹。e-l、n，所用小鼠同图 1g-s，检测体重、食物摄入、肝体比、血糖、AST、ALT、胆汁磷脂、胆汁胆固醇/磷脂比和肝组织免疫印迹。m，8 周龄雄性 Asgr1−/− 和野生型同窝小鼠给予高脂/高胆固醇/胆盐饮食 4 周后检测胆酸/鼠胆酸比。o-p，Huh7 及 ASGR1 KO 或 ASGR1 OE 细胞在 FBS 或胆固醇耗竭培养基中处理，并加入 25-羟基胆固醇。q-u，检测 ASGR1/ASGR2 沉默、质粒转染、Dil-LDL 摄取和 PCSK9 诱导 LDLR 降解。v，LDL 清除实验。w-x，VLDL 分泌实验。
扩展数据图 2 | 雌性 Asgr1−/− 小鼠表征
8 周龄雌性 Asgr1−/− 小鼠和野生型雌性同窝小鼠随机分组，自由摄水并给予高脂/高胆固醇/胆盐饮食 5 周。检测肝脏免疫印迹、肝脏基因 mRNA、体重、肝体比、血清 TC/TG、肝脏 TC/TG、ALT、AST、胆汁体积、胆汁胆固醇和胆汁酸等。p-z 使用图 2 所示小鼠，检测肝脏 mRNA、肝体比、肝脏 H&E 和 Oil Red O 染色、体重、食物摄入、血糖、ALT、AST、胆汁胆固醇、胆汁酸和胆汁体积。
扩展数据图 3 | ASGR1 调控 LXRα 降解的机制
该图展示 ASGR1 过表达或敲除、BRCA1/BARD1 沉默、MG132 处理、去唾液酸胎球蛋白 A 或去唾液酸血清类黏蛋白处理、ASGR1 配体结合突变、CHC 沉默、bafilomycin A1、dorsomorphin 和 A769662 处理对 LXRα 泛素化和降解的影响。图中还给出小鼠 ASGR1-配体复合物示意图，标明胞质区、跨膜区、柄区、糖识别结构域及配体结合关键残基。
扩展数据图 4 | ASGR1 介导的糖蛋白摄取增加溶酶体氨基酸并激活 mTORC1
a，免疫纯化溶酶体评估。b，野生型或 ASGR1-KO Huh7 细胞在有无去唾液酸胎球蛋白 A 处理时，溶酶体氨基酸变化倍数。c，溶酶体氨基酸转运蛋白 SLC38A9 对去唾液酸胎球蛋白 A 介导的 mTORC1 激活是必需的。d，野生型和突变 SLC38A9 的救援实验。e-f，去唾液酸胎球蛋白 A 促进 mTOR 溶酶体转位及共定位定量。g，比较去唾液酸胎球蛋白 A 和白蛋白作为氨基酸来源刺激 S6K 磷酸化的能力。
扩展数据图 5 | 注射去唾液酸胎球蛋白 A 激活肝脏 mTORC1、抑制 AMPK 并增加脂质水平
8 周龄雄性 Asgr1−/− 小鼠和野生型同窝小鼠随机分组，给予高脂/高胆固醇/胆盐饮食 2 天后腹腔注射去唾液酸胎球蛋白 A 9 小时。检测肝脏免疫印迹、肝脏 mRNA、体重、肝体比、血糖、ALT、AST、血清 TC/TG、肝脏 TC/TG、胆汁胆固醇、胆汁磷脂、胆汁胆固醇/磷脂比、胆汁酸、胆汁体积、总胆汁酸、总胆汁胆固醇、胆汁图像和肝脏染色。
扩展数据图 6 | 雷帕霉素抑制 mTORC1、激活 AMPK、增加胆固醇排泄并降低脂质水平
10 周龄雄性 Asgr1−/− 小鼠和野生型同窝小鼠随机分组并给予高脂/高胆固醇/胆盐饮食。小鼠每日灌胃载体或雷帕霉素 2 周。检测肝脏免疫印迹、肝脏 mRNA、体重、肝体比、血糖、食物摄入、血清 TC/TG、肝脏 TC/TG、ALT、AST、胆汁胆固醇、胆汁磷脂、胆汁胆固醇/磷脂比、胆汁酸、胆汁体积、总胆汁胆固醇、总胆汁酸、粪便胆固醇、胆汁图像和肝脏 H&E/Oil Red O 染色。
扩展数据图 7 | 肝脏 AMPK 敲低降低胆固醇排泄并增加脂质水平
8 周龄雄性 Asgr1−/− 小鼠和野生型同窝小鼠随机分组，并注射 AAV2/8-shAMPKα1、AAV2/8-shAMPKα2 或 AAV2/8-shControl。喂食高脂/高胆固醇/胆盐饮食或普通饲料 4 周后分析。检测肝脏免疫印迹、肝脏基因表达、体重、肝体比、血糖、食物摄入、血清 TC/TG、肝脏 TC/TG、ALT、AST、胆汁胆固醇、胆汁磷脂、胆汁胆固醇/磷脂比、胆汁酸、胆汁体积、总胆汁胆固醇、总胆汁酸、粪便胆固醇和肝脏染色。
扩展数据图 8 | A769662 与 GW3965 联合给药复现 Asgr1−/− 小鼠表型
8 周龄雄性 Asgr1−/− 小鼠和野生型同窝小鼠随机分组，给予高脂/高胆固醇/胆盐饮食。小鼠灌胃载体或 GW3965，或腹腔注射 A769662，持续 2 周。检测肝脏免疫印迹、肝脏基因表达、血清 TC/TG、肝脏 TC/TG、AST、ALT、胆汁胆固醇、胆汁磷脂、胆汁胆固醇/磷脂比、胆汁酸、胆汁体积、总胆汁胆固醇、总胆汁酸、粪便胆固醇和肝脏染色。
扩展数据图 9 | 沉默 Asgr1 增加胆固醇排泄并预防动脉粥样硬化
8 周龄 Balb/c 雄性小鼠注射 AAV2/8-shASGR1 或 AAV2/8-shControl，并给予高脂/高胆固醇/胆盐饮食 4 周。检测肝脏免疫印迹、肝脏基因表达、血清 TC/TG、肝脏 TC/TG、胆汁胆固醇、胆汁酸、胆汁体积、总胆汁胆固醇、总胆汁酸、体重、肝体比、ALT、AST 和肝脏染色。Ldlr−/− 小鼠实验中，检测血 TC/TG、ALT、AST、体重、肝体比、主动脉 Sudan IV 染色及斑块定量、肝脏染色。
扩展数据图 10 | 抗 ASGR1 中和抗体制备
该图展示单克隆抗 ASGR1 中和抗体的开发流程，HEK293T 细胞纯化 ASGR1 蛋白的考马斯亮蓝染色，原代肝细胞中不同抗 ASGR1 抗体克隆或 4B9 IgG 处理后的分析，Huh7 细胞中 4B9-IgG 对 ASGR1 区域识别的验证，以及图 4 所用小鼠的肝脏 mRNA、体重、食物摄入、肝体比、血糖、ALT 和 AST。
扩展数据图 11 | 接受抗 ASGR1(4B9-IgG) 和阿托伐他汀处理小鼠的表征
图 5a-l 所示小鼠用于该分析。检测肝脏基因表达、体重、食物摄入、肝体比、血糖、ALT、AST、胆汁胆固醇浓度、胆汁酸浓度，以及肝脏 H&E 或 Oil Red O 染色。
扩展数据图 12 | 接受抗 ASGR1(4B9-IgG) 和依折麦布处理小鼠的表征
图 5i-p 所示小鼠用于该分析。EZ 表示依折麦布。检测肝脏基因表达、体重、食物摄入、肝体比、血糖、ALT、AST、胆汁胆固醇浓度、胆汁酸浓度，以及肝脏 H&E 染色。
Nature Research Reporting Summary 摘要译文
Nature Research 希望提高发表研究的可重复性。本报告摘要用于为报告提供一致性和透明度结构。
统计
报告要求确认是否在图注、表注、正文或方法中提供精确样本量、测量是否来自独立样本、统计检验及单双侧、协变量、假设或多重比较校正、统计参数、P 值和效应量等信息。
软件和代码
数据采集软件包括 ImageJ 1.50i、Bio-Rad CFX Connect Real-Time System、Microplate Manager 6（SoftMax Pro 7.1）、Tanon Imager 5200 v2.03、Leica SP8 共聚焦显微镜及 Leica LAS X v3.5.2.18963。统计计算使用 GraphPad Prism 9 和 Microsoft Excel 2020。
数据
所有免疫印迹源数据见补充图 1；图 1、2、4、5 和扩展数据图 1、2、4-12 的其他源数据见源数据文件。支持本研究发现的二代测序数据已存入 NCBI GEO，登录号 GSE183013。其他数据可向通讯作者合理索取。
生命科学研究设计
样本量未通过统计方法预先确定，而是根据统计要求和该领域类似方法的既往研究确定。没有从分析中排除样本或动物。所有动物实验和体外实验至少重复两次，所有重复均成功。所有样本/动物随机分组。细胞和小鼠处理过程中研究者未实施盲法，数据分析也由非盲法研究者完成；原因是同一研究者执行相应流程，无法实施盲法。所有相关样本均以可重复方式进行分析。
材料、实验系统和方法
研究涉及抗体、真核细胞系、动物和其他生物体，不涉及古生物、人类研究参与者或临床数据。研究不涉及 ChIP-seq、流式细胞术或 MRI 神经影像。报告中列出了所用抗体的来源、货号、批号、稀释比例和验证信息。HEK293T 和 Huh7 细胞购自 ATCC，ASGR1-KO 细胞在本研究中通过 CRISPR-Cas9 构建。使用前未进一步鉴定细胞系；细胞经 PCR 检测支原体阴性；未使用常见误认细胞系。实验动物包括购自 GemPharmatech 和湖北疾控中心的 C57/B6J 小鼠、Ldlr 敲除小鼠、CRISPR-Cas9 生成的 Asgr1 敲除小鼠、Asgr1+/− 杂交产生的同窝对照，以及馈赠的 Lxrα 敲除小鼠。研究不涉及野生动物或野外采集样本。所有动物维护和使用均符合武汉大学机构动物护理与使用委员会指南。